DNA的复制、修复及重组DNA技术

63
1.剪切
2.重组
3.转化
4.筛选
5.检测分离
64
一、剪切

剪切对象

目的基因

载体
限制性内切酶

工具

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剪切对象

目的基因的获得
基因组DNA cDNA 人工合成DNA


常用载体
质粒 噬菌体 逆转录病毒

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质粒（plasmid)
52
三.修复机制
光修复机制 （低等生物） 不需光复活酶


嘧啶单体
280nm 239nm
嘧啶二聚体

需光复活酶

嘧啶单体 嘧啶二聚体 光复活酶（+）
蓝光
53
切除修复
1. UV特异核酸内切酶切除
DNA聚合酶Ⅰ填补、修复 DNA连接酶连接 2. 人体重要的修复方式 3.缺乏UV特异核酸内切酶 —— 着色性干皮病
一、大肠埃希菌DNA聚合酶（原核生物）
3’ 3,’5’-磷酸二酯键
5’
图12-4 17
DNA聚合酶Ⅰ 多功能酶 5’ 3’外切酶 3’ 5’外切酶 5’ 3’聚合酶 单链多肽 大小二个片段 切除RNA引物， 填补空缺 损伤后修复
DNA聚合酶Ⅱ与Ⅲ 多功能酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶
11
三、RNA引物
DNA聚合酶 RNA聚合酶 不能催化两个游离的 能催化两个游离的NTP dNTP在DNA模板上聚合 在DNA模板上聚合 需要具3’-OH的引物 提供3’-OH 引物最后要被DNA聚合 酶Ⅰ除去，缺口由该 酶补满，再由连接酶 连接
减少突变，提高DNA复制的真实性
第十二章
DNA的复制、修复及重组DNA技术
分子生物学的中心法则(central dogma)
RNA复制
转录 复制
翻译
DNA
逆转录
RNA
蛋白质
2
第一节 DNA复制的几个基本原则（特点）
一 、半保留复制 （semiconservative replication）
模板 原则 特点

亲代的DNA双链，每股链都可作为模板 按碱基配对原则指导新链的合成 合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲 代分子完全一样 一条链来自于亲代的DNA链，另一条链 是新合成的链
（复制方向与解链方向相反)
9
岗崎片段（Okazaki）： DNA复制时，一股以5’ 3’方向的母链 作为模板，指导新合成的链沿5’ 3’合成 1000—2000个核苷酸不连续的小片段称之为 岗崎片段。 岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。
10
半不连续复制： 在DNA复制过程中， 亲代DNA分子中以3’ 5’方向的母链作 为模板指导新的链以5’ 3’ 方向连续合成， 另一股以5’ 3’ 为方向的母链则指导 新合成的链以 5’ 3’方向合成1000—2000 个核 苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎 片段）， 这种复制方式称之为半不连续复制。
27
五、DNA连接酶

催化二段DNA链之间3’,5’ 磷酸二酯键的形成
5’ ATP AMP+PPi 3’ OH O 5’ O- P O O3’
有缺口的DNA链
DNA连接酶
5’
O O P O O-
3’
缺口封闭
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缺口填补: 连接双股DNA分子中一链的缺口


双链DNA分子中双链的缺口

不能连接二分子单链DNA
图12-17
端粒的环状结构
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第四节
DNA的损伤与修复
DNA修复的基础： 一条链有损伤 修复酶切除
以未损伤的链为模板 合成原来相同的序列
49
一.造成损伤的原因
自发因素 物理因素

化学因素


随机热碰撞 紫外线损伤（共轭双键） 电离辐射损伤（X线/线） 亚硝酸盐 C U G 5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥类 烷化剂 G 羟胺 C- 羟胺
7
前导链（leading strand）： DNA复制时，一股以3’ 5’方向的母 链作为模板，指导新合成的链以5’ 3’方 向连续合成的链称为前导链。 （复制方向与解链方向一致）
8
随从链（lagging strand): DNA复制时，一股以5’ 3’方向的母 链作为模板，指导新合成的链沿5’ 3’合 成，1000—2000个核苷酸不连续的小片段 的链称为随从链。
14
第二节 参与DNA复制的一些酶类和蛋白质 DNA链合成的条件 dNTP Mg++ 3’-OH引物 DNA模板 酶和蛋白质因子
15
酶和蛋白质因子 DNA聚合酶Ⅲ/Ⅰ DNA解链酶 DNA结合蛋白(SSB） 拓扑异构酶Ⅰ/Ⅱ 引发体 DNA连接酶

16
31
一.复制的起始
原核生物 真核生物 双向复制 多个复制单位（复制泡） （θ型复制） （复制起始点+复制叉） 特定起始点：oriC 多个起始点

32
大肠埃希菌复制起始点oriC的结构
33
原核生物双向复制（θ型复制）
34
真核生物复制泡（复制起始点+复制叉）35
DNA双链复制起始点
29
应用: 1.岗崎片段之间的连接.
2.DNA损伤修复中的连接.
3.一种重要的工具酶: 限制性内切酶切割后形成的粘性末端或 平头末端的连接.
30
第三节 DNA复制过程 (起始、延长、终止）



确定复制的起始点 解开双链DNA,提供单链DNA模板 形成复制叉 DNA合成的起始和延长 形成带有新合成的DNA片段的复制泡 复制的终止
解链、 解旋酶
5’
解旋酶 SSB
解链酶
3’
拓扑异构酶
dnaA dnaB/dnaC
SSB
引发体
DNA双链解开成单链DNA
SSB
3’
5’
引物酶
RNA引物/3’-OH
DNA聚合酶Ⅲ dNTP
和3’-OH形成3’5’磷酸二酯键
36
二.复制的延长
1.在DNA聚合酶Ⅲ的作用下， 2.前导链合成1000-2000个核苷酸后， 3.随从链开始合成，岗崎片段的长度 为1000-2000个（大肠杆菌） 4. PolⅢ为不对称二聚体， 一个作用于前导链， 另一个作用于随从链(loop)。
37
38
5’ 3’ 5’ 3’
图12-13
39
图12-14
40
三、复制的终止

源自文库
去除RNA引物

补充空缺

连接
DNA聚合酶Ⅰ的小片段 5’ 3’外切酶 DNA聚合酶Ⅰ的大片段 3’ 5’外切酶 5’ 3’聚合酶 DNA连接酶

41
3’ 5’
5’
3’
42
四、端粒DNA的复制
1.端粒(telomere) 真核生物染色体DNA是线性的 每复制一次，子链的5’有缺失。 3’端有特殊的序列,线性DNA末端的复制 必须的 ---端粒 端粒特征: 3’端是由数百个串联重复G丰 富的6个核苷酸组成（AGGGTT）n 人:5’-AGGGTTAGGGTT-------3’ 端粒能稳定染色体
不对称二聚体 单体1-前导链/单体2-随从链 DNA 复制的主要酶 高续进性 高聚合酶活性 高产物真实性

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DNA聚合酶Ⅰ（DNA PolymeraseⅠ） Kornberg酶 DNA指导的DNA聚合酶 （DNA-Directed DNA Polymerase, DDDP）
切除RNA引物 损伤修复
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第五节 重组DNA技术与基因工程
DNA重组（recombination of DNA) 自然界常见现象 两个DNA分子间/一DNA分子的两个不同部位之间

链断裂/片段交换重接 改变基因的组合和序列 交换可发生在同一细胞内（间）/不同生物
60
重组DNA 技术 实验室，人工的方法 不同来源/不同种属的DNA片段

切断DNA双螺旋中的一股， 张力下降后封闭。


切断DNA双链，使另一双 链经过此缺口，再封闭。
25
四、引发体（primosome） RNA引物的合成和复制的起始必需的
蛋白质 DnaA

DnaB 引物酶
结合到DNA双链复制起始部位 (需ATP) 解链酶的作用

合成RNA引物
26
43
线形DNA复制末端问题
44
2.端粒酶（telomerase) ----防止端粒缩短的酶 组成 蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板) 唯一携带RNA模板的逆转录酶 人端粒酶: 模板(RNA-端粒酶):3’-CAAUCCCAAUC-5’ 合成(DNA): 5’---AGGGTT---3’ 端粒酶和衰老、肿瘤有关

23
三、解链、解旋酶类

DNA解链酶 （helicase）

解开DNA双链 每个bp消耗2个ATP

DNA结合蛋白(SSB） 与单链DNA结合,维持单链 状态 (“镇纸”) 使其不受核酸酶水解 避免单链DNA自身发夹螺旋 形成 使前端螺旋易解开
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拓扑异构酶Ⅰ （topoisomerasⅠ） 转轴酶 拓扑异构酶Ⅱ 旋转酶 （gyrase）

核心聚合酶 二聚体形式连接两个 核心聚合酶 单个运载夹钳

星环状,容纳DNA双链
20
21
22
二、真核细胞的DNA聚合酶

五种 DNA 聚合酶α DNA聚合酶δ和PCNA DNA聚合酶γ DNA聚合酶β、ε
参与随从链的合成 参与前导链的合成 参与线粒体DNA的合成 参与DNA的修复
12
3’ 5’
前导链
5’ 3’
3’ 5’
岗崎片段
3’ 5’ 随从链
RNA引物
3’-OH
13
四、复制的真实性 DNA的半保留复制 遵守严格的碱基配对规律 RNA引物 DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 复制出错是有即时的校读功能(3’ 5’ 外切酶功能） DNA损伤的修复机制
N
校读功能 3’ 5’ 外切酶
聚合功能 5’ 3’ 聚合酶
5’ 3’ 外切酶
小片段
C
大片段（ klenow片段）
（常用的工具酶）
19
DNA聚合酶Ⅲ全酶 （DNA Polymerase Ⅲ holoenzyme） 10种不同亚基组成 θαε τ

γ2 δ δ’ χψ DNA聚合酶Ⅲ※ β(4个) DNA聚合酶Ⅲ全酶
54
4个核苷酸
8个核苷酸
3’-OH
扩创
55
碱基修复
1. DNA糖苷酶识别切除改变的碱基
核酸内切酶切除磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ填补
DNA连接酶连接
56
2.识别的酶：
（1）一类DNA糖苷酶，各具特异性
e.g.尿嘧啶DNA糖苷酶—识别DNA中的U （由C突变而来） （2）作用： 识别-----DNA中改变的碱基 水解-----改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键 改变的碱基脱落
45
3.端粒酶的作用机制
DNA末端
1.RNA和DNA单链 互补序列识别结合
2.以RNA为模板 的逆转录过程
3.再发动新一轮的合成延长, 合成较长的重复序列
46
4.以延长的DNA单链为模板, 3’-OH为引物合成富含C的 互补链
47
5.哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构, 环状DNA+蛋白质 保护染色体3’端的稳定

3
亲代DNA
子代
新合成 的链
子代
半保留复制
4
5
二、半不连续复制 （semidiscontinuous replication） 1、 体内仅存在5’ 3’的DNA聚合酶
2、 前导链与随从链（岗崎片段）
6
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’ 3’ 5’
前导链
岗崎片段
3’ 5’ 随从链
半不连续复制

拼接成重组DNA分子
引入活细胞内 大量复制/表达
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基因工程/遗传工程/克隆
克隆（clone): 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代 完全相同的子代群体。
62
（三）重组DNA技术的基本步骤 1.目的基因的获得 2.目的基因与载体的连接 3.重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆 5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化
50
A
二.DNA损伤类型
点突变 类型


结果


转换----同型碱基 颠换----异型碱基 启动子/剪接信号 编码序列 中性变化 静止突变
影响整个基因功能 蛋白质功能改变 AA变化，功能不变 碱基变，AA不变
51

缺失 插入 倒位

一个碱基/一段核苷酸/整个基因 一段原来没有的碱基/核苷酸序列 DNA链内部重组，一段方向颠倒
57
1
2
3
4
58
3. DNA碱基的组成为何是“T” ？ （1）DNA中的C容易突变成U （2）尿嘧啶DNA糖苷酶—识别DNA中的U （由C突变而来） （3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U （4）所以DNA中U甲基化/耗能生成T （5） DNA碱基中T的存在， 增加遗传信息的稳定性 （6）RNA中的U：数量多/半衰期短/经济