龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究

12 25
24
8
48 131. 5 11. 32
50
16. 7
100
P 1652L iC l
菌株数
4
2
6
18
8
8
4
50 116. 9 19. 92
分布频率
8
4
12
36
16
16
8
100
P 1652O TC2L iC l 菌株数 分布频率
2
4
6
12
·262·
表 4
高产菌株产势参数分析
菌株 参数
N T GO 28
P1652O XY213
P1652KM 210
1625 (Ck)
n
67
x
99. 07
S
7. 00
Ct
14. 14
Cs
- 0. 38
48 98. 77 5. 44 18. 18 0. 31
89 101. 37 5. 79 17. 52 - 0. 46
6) (1 6) (1+ C s 8) (1 2)
对照提高了 8. 1%、7. 3% 和 7. 0% , 因此, 346# 菌株比 较稳定, 且产量比对照平均提高了 7%。 2. 3 346# 菌株传代试验结果
346# 连续六代摇瓶发酵各代产量经方差分析它 们之间无显著差异, 说明 346# 菌株有较稳定的产抗生 素遗传特性。 但从试验结果看, 346# 一至三代产量明 显高于四、五、六代菌种, 因此最好用前三代菌种进行 发酵。 2. 4 高产菌株摇瓶发酵代谢试验结果
37 100
10. 27 9. 61 - 2. 13
A
111. 54
121. 28
117. 66
91. 56
X: 相对产量的平均值; S: 相对产量的标准差; C t: 产量分布的稳 度 (X S) ; C s: 产量的偏度 2 (X i- Xϖi) 3 n S3; 产势 A = x (C t
表 3 高产菌株摇瓶产量方差分析表
产、稳产、不易蜕变的特征, 用产势 A = x (C t 6) (1 6) (1
变异 来源
处理 误差 总和
自由度 DF
13 28 41
平方和 SS
47081 1861
48942
均方 MS
3621. 6 66. 5
F值 54. 493 3
F. 05 (13, 28) F. 01 (13, 28)
15% 为入选标准, 从 P 1652O TC28 的自然分离株中进 行复筛得到346# 菌株, 3次复筛平均摇瓶产量分别比
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0
0
抗药突变率 (% ) 0 0
0
0
N T G 处理原 O TC (2500)
51
生质体
L iC l (6000)
69
O TC (2500) +
21
L iC l (6000)
KM (120)
42
0. 0008 0. 0011 0. 00033
0. 0006
·261·
0. 0006%。 2. 2 高产菌株摇瓶筛选结果 2. 2. 1 1625# 菌株原生质体诱变突变株初筛结果 以 对照菌株平均产量为 100% , 初筛分析统计结果见表 2。 1625# 原生质体对 O TC、L iC l、L iC l+ O TC、KM 抗 药性突变株其产抗生素能力正突变频率较大 (80% 以 上) , 根据初筛结果相对产量在 120% 以上作为初筛入 选标准。 2. 2. 2 高产菌株的摇瓶复筛结果 初筛入选菌株进 行二级摇瓶复筛, 试验结果进行方差分析 (见表 3) 可 知: 各菌株之间与对照相比差异显著。筛选得到 P1652 48、P 1652O TC213、P 1652KM 210、N T GO 28 4 菌株分别
表 2
1625# 菌株原生质体不同诱变剂处理抗药性突变株摇瓶初筛统计结果
相对产量组距 90% 以下
1625# 自然分离 菌株数 分布频率
原生质体再生 菌株数 分布频率
6 8. 11
90%～ 100% 100%～ 110% 110%～ 120% 120%～ 130% 130%～ 140% 140% 以上
1. 2. 2 原生质体 N T G 诱变和抗药性突变株检测
将制备好的 1625# 菌株原生质体 5m l 置于含有 N T G
( 2m g L ) 的 5m l P 溶 液 的 100m l 三 角 瓶 中, 30℃,
220r m in 摇瓶机上诱变处理 30m in, 诱变原生质体液
经 P 液适当稀释, 各吸 0. 1m l 原生质体诱变稀释液分
斜面麸皮培养基 (% ) : 麸皮 7. 5, 琼脂 2. 2。 初筛摇瓶培养基 (% ) : 玉米淀粉 7, 酵母粉 3, 黄豆 粉 6, CaCO 3 1. 4, N aC l 0. 4, KH 2PO 4 0. 15。 分离培养基、复筛摇瓶培养基及大罐发酵试验培 养基与生产厂相同。 1. 1. 3 溶液 pH 6. 0, 磷酸缓冲液; P 溶液[4], N T G 诱 变液[5 ]。 1. 1. 4 试剂及有关药品 T ES: M erck 公司产品 (批 号 140 F 265495) ; N T G: O xo id 公司; 溶菌酶: Sigm a 公 司生产 (进口分装) ; 土霉素标品 (O TC ) : 卫生部药品 司提供; 硫酸链霉素 (SM ) : 上海市第四制药厂生产 (批 号 96063022) ; 硫酸卡那霉素 (KM ) : 湖南岳阳制药二 厂生产 (批号 950624) ; 甘氨酸 (G lycine) (B. R 级) : 中 国科学院上海生化所生产 (批号 960826)。 1. 2 方法 1. 2. 1 龟裂链霉菌原生质体制备方法[6]
2 结果与讨论
2. 1 1625# 菌株原生质体诱变和抗药性突变株检测
1625# 菌株原生质体的诱变和抗药性突变株的
检测结果见表 1。 1625# 原生质体经N T G 处理后分别
在 O TC ( 2500m g L ) , L iC l ( 6000m g L ) , O TC ( 2500
m g L ) + L iC l (6000m g L ) 和 KM (120m g L ) 平板上
·260·
中国抗生素杂志 2000 年 8 月第 25 卷第 4 期 文章编号: 100128689 (2000) 0420260203
龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究
郭美锦 涂国全 曹秀香
(江西农业大学生物技术研究开发中心, 南昌 330045)
摘要: 采用定向推理筛选方法对龟裂链霉菌原生质体进行诱变筛选得到 346# 菌株, 其复筛时比对照
26. 1% 和 19. 98% , 说明这 3 个菌株均具有比对照菌
比 对 照 的 产 抗 生 素 水 平 提 高 了 19%、19%、17% 和 株更高的产抗生素潜力。
16% (数据未列)。
通过诱变突变菌株产势参数分析, 以比对照提高
2. 2. 3 高产菌株稳定性试验和产量分布参数评价 根据刘垂于研究文献[ 8 ] 认为优良的生产菌株应具有高
从 346# 和 1625# 代谢曲线看, 346# 起步产量比对 照低 3. 62% , 这可能主要是其糖代谢速率较慢造成 的, 30h 后糖耗加快, 效价同时提高加快, 最终放瓶产 量比对照高 7% 左右。 2. 5 346# 菌株大罐发酵结果
346# 菌株大罐试验连续发酵 9 罐批 (以 1625# 为 对照发酵) , 其平均放罐总亿和发酵指数比 1625# 平均 放罐总亿和平均发酵指数均提高了 13% 以上。按 1993 年英国药典 H PL C 条件, 以甲醇为流动相测定试验产 品, 对照产品和 O TC 标品组分, 其主要组分完全一
别涂布于含有致死浓度抗生素的 R 5 再生培养基上,
34℃培养 5～ 7d, 分别计算再生菌落数。
同时各吸 0. 1m l 未诱变处理的原生质体稀释液
分别涂布在未含药物的 R5 再生培养基上和分别含
O TC、L iC l 和 KM 的 R 5 再生培养基上以分别作为
CK1, CK2, CK3 和 CK4。
1. 2. 3 自然分离选育方法[7]
1. 2. 4 筛选方法 初筛为一级摇瓶筛选, 复筛为二级
摇瓶筛选。
1. 2. 5 代谢试验方法 复筛方法, 每隔 12h 取二瓶发
酵液测定其总糖、氨基氮、溶磷、pH、效价。
1. 2. 6 大罐试验方法 采用三级发酵法。
1. 2. 7 测定方法 初筛化学效价为改良法即反应体
26 35. 14
42 56. 75
4 6. 67
8 13. 33
18 30
18
12
30
20
总计 74
60 100
平均产量 标准方差
(X )
(S)
100. 0 10. 42
129. 9 11. 74
P 1652O TC 菌株数 分布频率
2
0
4. 17
0
2 4. 17
6
6. 67
13. 33
20
40
20
30 120. 9 11. 16 100
P KM 菌株数 分布频率
总计 菌株数
10
2 6. 66
34
2 6. 67
58
6 20
40
8 26. 67
58
6
6
30 127. 9 18. 15
20
20
100
62
30
292
龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究 郭美锦等
表 1 N T G 诱变 1625# 原生质体诱变效果
试验处理
未经N T G 处 理原生质体
药物浓度 (m g L )
CK1 CK2 (O TC 2500) CK3 (L iC l 6000) CK4 (KM 120)
再生菌落数 (个 m l) 6. 3×106 0
中国抗生素杂志 2000 年 8 月第 25 卷第 4 期
致。 3 结论与讨论
通过对 1625# 菌株的原生质体进行强诱变剂诱变 和复合诱变处理得到了高产抗生素的 346# 菌株, 其连 续 9 批 60T 大罐发酵指数比对照提高了 13%。抗生素 产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基 因紧密连锁, 当抗药性基因发生突变时, 其抗生素合成 的相关基因也相应发生突变。因此, 这种抗药性突变标 记的推理性筛选土霉素高产菌株效率高且行之有效。
产量高 7% , 而在 60 吨大罐上连续发酵 9 批, 发酵指数比对照高了 13%。 关键词: 龟裂链霉菌; 原生质体; 定向推理诱变; 土霉素 中图分类号: Q 933 文献标识码: A
经典的诱变育种是菌种选育的基础方法, 但其具 有盲目性和随机性。利用推理选育, 可定向地选出某些 类型的突变株, 从而筛选出高产菌株。 袁丽蓉[1]、范铭 琦等[2]用这种方法选育菌种取得了较好的效果。 龟裂 链霉菌发酵生产土霉素时, 土霉素分泌到菌丝体外, 当 发酵液中土霉素达到一定浓度后因菌丝体自我调控而 使效价难以提高, 为此, 采用诱变剂通过筛选耐高浓度 的土霉素的菌株作为解除选育终产物的抑制的定向推 理, 获得了高产菌株 346# , 现报道该研究结果。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 供试菌 S trep tom y ces rim osus (1625# ) 由江西 洪城制药厂提供。 1. 1. 2 培养基 S 生长培养基[3 ]; R 5 再生培养基[3 ]。
2. 09
2. 85
+ C s 8) (1 2) 的数值来评价生产菌株, 产势 A 愈大, 菌 株愈优。 由表 4 参数分析可知: P 1652O XY213, P 1652 KM 210 和 P 1652O TC 28 3 个高产菌株自然分离菌株 的产势 A 值分别比对照 1625# 菌株提高了 29. 72%、
系中 0. 27m o l L HC l 为 4. 9m l, 吸样 0. 1m l, 加显色液
0. 5% FeC l3 5m l 混匀, 在室温下反应 20m in 后于波长
500nm 比色。 复筛化学效价为化学比色法。
总糖 斐林氏法;
NH
+ 4
2N
甲醛滴定法;
溶磷
钼兰比色法; 组分测定 H PL C 法。
抗药突变率依次为0. 008% 、0. 0011% 、0. 00033% 和
百度文库
收稿日期: 1999207222 作者简介: 郭美锦: 男, 生于 1969 年, 华东理工大学在读博士生, 助理研究员。
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