荧光分光光度法

荧光分光光度法测定维生素B6的含量

荧光分光光度法测定维生素B6的含量

荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。

荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．

不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的

特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。

在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。

②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。

荧光分光光度计是用于电子扫描液相荧光标志物所拍发的荧光光谱的一种

摄谱仪。应用于科学研究、化工、医疗药品、生化、环保和临床检验、食物检验、讲授实验等领域。

本次实验所用样品维生素B6（vitamin B6），又称吡哆素。是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。一种含吡哆醇或吡哆醛或吡哆胺的B族维生素。1936年定名为维生素B6。维生素B6为无色晶体，易溶于水及乙醇，在酸液中稳定，在碱液中易破坏，吡哆醇耐热，吡哆醛和吡哆胺不耐高温。维生素B6在酵母菌、肝脏、谷粒、肉、鱼、蛋、豆类及花生中含量较多。维生素B6为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。临床上应用维生素B6制剂防治妊娠呕吐和放射病呕吐。

维生素B6及其辅酶的结构式

1 实验仪器与试剂

1.1 仪器

荧光分光光度计（RF-5301PC,日本岛津）、电子天平（AL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司METTLER TOLEDO）、微孔滤膜（尺寸25mm，孔径

0.8μ，上海半岛实业有限公司净入器材厂）

1.2 试剂

维生素B6片（10mg/片，新疆西域药业有限公司，批号10020402）：取20片称重，并研磨成粉，备用，计算得药粉的平均片重为73.93/mg。

维生素B6贮备液溶液（195.4μg/ml，实验室提供）

盐酸(0.01mol/ml，实验室提供)

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 标准溶液制备

维生素B2的浓度线性范围为2μg/ml-10μg/ml，储备液的浓度为194.4μg/ml。故分别移取0.25ml、0.50ml、0.75ml、1.00ml和1.25ml储备液。用盐酸(0.01mol/ml）稀释至25ml即得。

2.1.2 样品溶液制备

平行称量样品10.14mg、10.62mg、10.76mg，分别用盐酸溶液溶解，定容至25ml容量瓶中，再分别移取3ml稀释至25ml即得。

2.1.3 确定激发、发射波长

根据UV光谱确定激发波长λex和发射光谱的范围，固定激发波长，再选定范围扫描发射光谱；再根据发射光谱确定发射波长λem和激发光谱的范围，固定发射波长，在选定范围扫描激发光谱。最终确定激发波长与发射波长。

激发光谱与发射光谱图见图1、图2。

荧光定量分析维生素B6的参数设定：激发波长λex＝290nm，发射波长λem ＝386nm，狭缝宽度(3,3)，纵坐标扩展0-200。

2.1.4 测量

设定好参数后，转换进入计算模式。重新进行空白调零，分别对5个不同浓度的标准溶液进行3次平行检测。再将样品溶液过滤后进行荧光检测，同样平行测量3次。

图1 维生素B 6激发光谱 图2 维生素B 6发射光谱

编号 浓度（μg /ml ） F 1 F 2 F 3 F （平均值） RSD% 1 1.954 158.302 157.140 157.406 157.616 0.4971 2 3.908 266.392 265.242 263.602 265.079 1.1445 3 5.862 398.063 395.364 392.663 395.363 2.2045 4 7.816 455.308 453.260 450.710 453.093 1.8809 5

9.770

524.874

524.026

521.300

523.412

1.5247

图3 维生素B6的浓度与荧光强度的标准曲线

在2μg/ml-10μg/ml浓度范围内，维生素B6的浓度与荧光强度成线性，标准曲线方程：F=47.063C+83.0308，相关系数：r=0.9883。

2.2.2 精密度试验

分别精密量取该维生素B6储备液（194.4μg/ml）0.25、0.5、0.75ml 置25ml容量瓶中，加盐酸溶液(0.01mol/ml)稀释至刻度，摇匀即得，照荧光分光光度法，在上述条件下测定荧光强度F。平行操作3份。

表2 精密度实验

浓度（μg/ml）荧光强度F 测定浓度（μg/ml）均值±RSD

16.28

32.57

48.85

2.2.3 回收率实验