第二章--细胞破碎与提取要点

包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表 达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为 此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离 包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢 复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅 增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为 生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机 理研究提出了新的课题。
三、包含体及其纯化
例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累
包涵体（inclusion bodies），或包含体，是无定 形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破 碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以 沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐 酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的 蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被 破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键 不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质 可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠 过程称为蛋白质的复性。
第二章 蛋白质的制备 ---细胞破碎与萃取
第一节 蛋白质制备总则
一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性
二、方法选择依据： 根据不同蛋白质的性质和研究目的
1、蛋白质的性质：
来源、 胞内（胞外）、 可溶性、 分子大小、 等电点、 稳定性（对温度、pH、蛋白酶、金属离子的耐受性）等
2、研究目的：
考虑产品的质量、数量和经济性 越到后面的纯化越困难，增加成本，延长操作时间，收率低
（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）
3、根据蛋白质性质确立分离方法
溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析 电荷不同：电泳，离子交换 分子形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤
四、蛋白质的制备流程： 原料液
细胞分离(离心，过滤)
细胞－胞内产物 清液－胞外产物
细胞破碎
包含体
碎片分离
溶解(加盐酸胍、脲) 复性
适用：细菌及病毒中对热不太敏感的物质
㈢．化学法
1． 溶剂处理法： 丙酮、氯仿、甲苯等
溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。
2． 表面活性剂法
破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。
（四）酶解法
1． 自溶法
保温一定时间，通过细胞本身的酶将细胞破坏。
2． 外加酶法
将细胞壁分解，使内含物释放出来。 细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA） 酵母：采用β-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。
粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 纯化(层析、电泳)
浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
首先：
材料的选择和预处理 细胞的破碎和细胞组分分离 有效成分的萃取
第二节 材料的选择、预处理与保存
一、原料选择原则： ➢有效成分含量高、原料来源丰富，易得； ➢原料中杂质含量少； ➢原料成本低等；
1.组织捣碎机： 适用：动植物组织 2.匀浆器 适用：较柔软、易分散的组织细胞 3.研钵 适用：微生物（细菌）与植物细胞
㈡ 物理法
1．超声波破碎
2．渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆弱的微生物。
细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外 渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或 将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞 外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂
有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。
（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原
料，如发酵液、提取液等。
第三节 细胞破碎
一、破碎方法的原则和依据
原则：最大提取、不易变性、减少干扰
具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。
1、材料细胞的特性
动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法 植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法 微生物细胞较复杂，一般用较强的方法
2、包含体的构成
包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。
基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误 的，所以没有生物活性。
分离包含体后，需使目标蛋白恢复应有的天然活性。 （蛋白质折叠）
工业化应用：经济性（高收率，纯度次要） 一般研究：80%-90%纯度 结构研究：95%以上纯度 医疗：全面分析
三、确立有效成分的测定方法
1、蛋白质初步提取和浓缩
吸附法 超滤法 沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀） 透析
三、确立有效成分的测定方法
2、蛋白质高效分离纯化
色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等） 电泳法
3．反复冻融法：-15℃～-20℃， 适用：动物材料
将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或 40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰 粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方 法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜 采用此法。
4．急热骤冷法： 85～90℃数分钟，冰浴冷却
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了 崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪 元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物 时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌 为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、 人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人 γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且 在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包 涵体（inclusion bodies IBs)。
2、目的物的特性
⑴．细胞中的位置 游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。 结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎
⑵．敏感性 温度、pH、氧、剪切力、杂酶ห้องสมุดไป่ตู้影响
⑶. 处理量 有些处理量大，如组织捣碎机等。 有些处理量少，如超声波破碎等。
二、破碎方法
㈠ 机械法
原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞 具体方法：
注意动物的 年龄与性别
微生物生长 的对数期
植物采收 具有季节性
二、原料的预处理：
动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、
脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。
植物原料：要择时采集并就地去除不用的的部分，
有用部分保鲜处理。
微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。
三、原料的保存方法
（1）冷冻法：适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。 （2）有机溶剂脱水法：丙酮，该法适用于原料少而价值高、