双向电泳原理与流程详解

PMF LCMS/MS State 2 Database search MS/MS
?
Functional analysis
12 / GE Title or job number / 7/28/2015
Proteomics 2DE Workflow
Sample labeling
Sample Prep Image acquisition Protein Separation
21 / Principle according to P.H. O’Farrell and J. Klose (1975) GE Title or job number / 7/28/2015
使用载体两性电解质IEF时存在的问题
• 不同批次载体两性电解质的重现性 • 载体两性电解质梯度不稳定 • 蛋白载量有限 • 重现性差导致梯度漂移 • 梯度漂移导致酸性和碱性蛋白质丢失 • 管胶柔软，尺寸不定 • 操作者个人技术影响结果
等电聚焦电泳原理
蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所 处环境酸碱度的变化而变化。
19 / GE Title or job number / 7/28/2015
等电聚焦电泳原理
等电聚焦（IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正 极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运 动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值， 便可以得到它的等电点。
5/ GE Title or job number / 7/28/2015
理论 pI and Mr 图
1000
酵母细胞表达6,216种蛋白
至今1,484个蛋白被鉴定 (Nat.Biotechnol. 17,676 and 19, 242)
2DE 工作范围
100
Mr [kDa]
10
注: 图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性
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遗传育种和分子育种
寻找差异蛋白质
细 胞
环孢素A处理前
环孢素A处理后
组 织
正常 组织
肿瘤组织
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Life Sciences 的历史
LKB
——电泳发明者 Pharmacia
• 分辨率非常高 • 2D 可以有效的组分收集器
• 蛋白在凝胶介质中受到保护
• 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ） • 与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多 • 与后续分析技术兼容性好 (如. MDLC)
7/ GE Title or job number / 7/28/2015
Why 2DE?
Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches. The core technology of proteomics is 2-DE. At present, there is no other technique that is capable of simultaneously resolving thousands of proteins in one separation procedure.
Stanley Fields, University of Washington, Seattle, in Science [291, 1221 (2001)]
2/ GE Title or job number / 7/28/2015
Proteomics
一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称 为蛋白质组(proteome)
The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed
The Multiphor™ flatbed electrophoresis unit is launched. In production for 30 years in 2003!
双 向 电 泳 技 术
1/ GE Title or job number / 7/28/2015
Proteomics
“...the analysis of complete complement of
proteins. Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function."
“Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug discovery, diagnostics and therapy.”
Two basic technologies:
20 / GE Title or job number / 7/28/2015
双向电泳：传统方法
一向:
垂直胶管中进 行等电聚焦
二向:
SDS 丙烯酰胺凝胶电泳 胶在SDS 缓 冲液中平衡
urea, NP-40
sample
非连续梯度胶
pH 3 pH 10
pH 10
pH 3
按等电点分离（电荷）
按分子量分离（质量）
2002 2000 2000 1998
Amersham Pharmacia Biotech launched Typhoon™
Pharmacia Biotech launched DALT II system
Pharmacia Biotech introduced IPGphor™
1993
1991 1982 1979 1978 1973 1967
微生物
样品制备
分离
染色
图谱分析
植物
体液
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向 第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
蛋白鉴定
15 / GE Title or job number / 7/28/2015
样品制备
• 细胞破碎 • 蛋白沉淀 • 溶解 • 抑制蛋白酶活性 • 去除 核酸 脂类 盐，缓冲液，离子性小分子 不溶性物质
From: Wildgruber et al. Electrophoresis 21 (2000) 2610-2616
.
14
1 2 4 6 8 10 12
pI (理论值)
6/ GE Title or job number / 7/28/2015
2D 电泳优越性
• 对未处理样本耐受性好
- 不需要预纯化 (如：色谱层析)
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2D/MS 经典工作流程
细胞
蛋白标记
组织
差异分析 挖点 酶解 点靶
微生物
样品制备
Separation
染色
图谱分析
植物
体液
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向 第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
Proteome Analysis and Proteomics
"The analysis of the entire PROTEin complement
expressed by a genOME, or by a cell or tissue type."
Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995)
——层析ห้องสมุดไป่ตู้术开创者
Amersham Biosciences
——提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案
GE Healthcare Life Sciences ——实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破
GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis
Amersham Biosciences launched Ettan™ DIGE
2-D electrophoresis gel from Prof. Dr. A. Görg, Technical University Munich, Germany
14 / GE Title or job number / 7/28/2015
2D/MS 经典工作流程
细胞
蛋白标记
组织
差异分析 挖点 酶解 点靶
2. Second dimension: SDS electrophoresis separation according to the molecular weight
2-D electrophoresis resolves a few thousand protein spots.
18 / GE Title or job number / 7/28/2015
仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象, 因为蛋 白质才是生命活动的真正执行者 从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性 剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象; 此 外并不是细胞内的所有的DNA都翻译转录成蛋白质
3/ GE Title or job number / 7/28/2015
2-D electrophoresis of complex protein mixtures Identification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methods
4/ GE Title or job number / 7/28/2015
蛋白质组学应用举例
研究细胞结果功能和分子组成 发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物 发现新型生物学活性的分子和药物 研究药物作用方式和毒性机理 相互作用蛋白质组学 病理生理学研究
差异蛋白质组学
发现新的药物靶位点 遗传或药理学扰动的分子解剖
海洋生物
修饰蛋白质组学 植物抗虫抗旱抗逆
中药机理
资源环境
Pharmacia Biotech introduced ImageMaster™ suite
Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip
LKB introduced Immobiline™
Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte™
LKB introduced Ampholine™, the first commercial carrier ampholyte
11 / GE Title or job number / 7/28/2015
2DE在蛋白质组学方 案中所处的位置
Differential analysis 2DE
State 1
蛋白鉴定
17 / GE Title or job number / 7/28/2015
Principle of 2-D Electrophoresis
1. First dimension: denaturing isoelectric focusing separation according to the isoelectric point
LWS Laboratory workflow system
MALDI-ToF
Spot digestion
Image analysis
Automated spot picking
MALDI target spotting
13 / GE Title or job number / 7/28/2015
小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳