病理学新技术进展

6、对照的使用
传统的阳性对照 在每组中设臵已 知为阳性的对照。 确保所有试剂均 有效，操作步骤 正确。
传统的阴性对照 每例其中的一张切 片由正常血清代替。 目的在于判定非特 异性染色的有无。
设臵阳性对照的结果
传统阳性对照占免疫组化染色切 片的20-40%，因此十分昂贵！ 只表明所有试剂“正常”，不能 保证被添加的试剂种类是否正确。 有时是不必要的！内部阳性对照 更好，或者同一组的其它病例可 作为对照。
良性还是恶性？ B细胞/浆细胞增生性病变，如果出 现轻链限制性则支持恶性肿瘤。 出现异常免疫表型，如B细胞同时 表达CD43、CD5或 cyclinD1则支持B细胞 淋巴瘤的诊断。 除个别例外，任何淋巴组织增生出 现ALK1表达，均提示大细胞淋巴瘤。
肿瘤诊断
良性还是恶性？ 增生标记物——Ki-67 如果在脑膜瘤、胃肠道间质肿瘤或 甲状旁腺肿瘤中Ki67 指数很高，提示为恶 性。 Ki-67染色可以帮助鉴别萎缩上 皮（少数细胞阳性）和CINIII（多数细胞 阳性）。
肿瘤诊断
生殖细胞肿瘤分类 生殖细胞瘤：常Cytokeratin - 、 胎盘碱性 磷酸酶+ 胚胎性癌： Cytokeratin+ 、 AFP+/ 卵黄囊瘤： Cytokeratin + 、 AFP + 滋养叶或绒癌：Cytokeratin + 、 AFP- 、 HCG+
肿瘤诊断
淋巴瘤分类 确定瘤细胞谱系：L26 （B细胞）， CD3 （T细胞），CD56（NK 细胞） 淋巴母细胞瘤：TdT 套细胞淋巴瘤：Cyclin D1 滤泡性淋巴瘤：CD10 或 bcl-6 间变性大细胞淋巴瘤：CD30 、 ALK1 Burkitt 淋巴瘤：Ki67 （几乎100% 细胞阳 性）
组织固定
为了获得理想的固定时间需要平衡下列因素： 尽可能快的制出用于诊断的切片； 在福尔马林中充分固定，至少需要 2-4小时；… 长时间固定会损害抗原活性。
组织固定时间对抗原活性的影响
一般而言，固定时间越短，免疫组化染色 结果越强。 相反，固定时间越长（尤其在福尔马林中 固定时间超过数天），免疫组化染色结果 越弱。
由于不同部位的鳞（样）癌不表达不同表型， 因此没有太多可用的标记物. CD5：阳性表明胸腺起源 CK20：阳性提示膀胱移行细胞癌 原位杂交检测EB病毒：阳性提示鼻咽癌或EB 相关癌
1、肿瘤的诊断
判定“未分化”或“低分化”肿瘤的本质：最有用的 试剂组为 Pan-cytokeratin, 如MNF-116,或角 蛋白的混合物——上皮性肿瘤 LCA ——淋巴瘤 S-100 ——恶性黑色素瘤，部分癌亦 可呈阳性表达
Vimentin完全无用，不能提供任何信息——许 多癌和淋巴瘤均表达阳性，对肉瘤不特异。
病理技术进展
南华大学病理教研室 谢海龙
生命科学研究成为整个人类科学领域最具 活力、发展最快的领域。 正是这种飞速的发展及更新，我们医务工 作者必须适应这种变化，及时更新自己的 知识结构，并能及时地应用到我们的工作 中。
本讲座就近年来在病理学领域的最新 技术及相关理论作一综述，希望对大 家在今后的医疗实践或科学研究中提 供一定的帮助。
AFP
肿瘤诊断
是否为肝细胞癌（HCC）？ 目前最好的肝细胞分化标记物 是HEP-PAR1（>90%肝细胞癌阳性）。 对于年轻患者，还要除外上皮 样血管平滑肌脂肪瘤 ：HMB45最有帮助。
肿瘤诊断
是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤（如颗粒细 胞瘤或支持细胞瘤）？ 目前有以下几种性索细胞标记物： Inhibin CD99 MART-1（黑色素瘤相关标记物）
内部对照
尽可能寻找合适的内部 阳性对照（尽管并不能 总找到） 最可靠。 细胞固定方式及其它处 理过程相似。
免疫组化结果的评定
准确评定免疫组化结果与认真操作 同等重要。 判定染色结果时需结合形态学，确 保染色的为病变细胞或基质，而非 其它组织或非特异染色。
免疫组化结果的评定
阳性结果较阴性结果更有意义， 因为很多因素均可导致阴性结果 （如抗原丢失、方法不敏感）。 因此在鉴别诊断“A”与“B”病变 时，组配的抗体中应包括对“A” 和“B”病变阳性的抗体。
一线抗体
────────────────────── Keratin Vimentin LCA ────────────────────── 癌 ＋ － － 肉瘤 － ＋ － 淋巴瘤 － ＋ ＋ 神经源性肿瘤 － ＋ － ──────────────────────
S-100 － － － ＋
肿瘤诊断
用于免疫组化染色组织块的选择
很显然组织块应该含有病变。 如果可以同时得到多个组织块，应避免使用 下列组织块： 固定时间较长的组织块; 冻融后的组织块; 脱钙后的组织块（一些抗原可能丢失或 减弱）。
2、抗原修复
固定液（固定剂醛基遮蔽部分抗原决定簇）可 以导致蛋白质分子内及分子间交联，从而遮蔽 抗原决定簇。 如果不进行抗原修复，免疫组化染色结果常不 理想或失败。 抗原修复可能通过破坏分子交联发挥作用。
4、显色原的选择
个人爱好。 DAB：耐酒精；染色产物定位好；使用铜、镍或 咪唑色彩易于强化 。 AEC：不耐酒精，敏感性差。 Fast Red 或 新Fuchsin（碱性磷酸酶系统 ）： 染色产物定位不好；敏感性差。
DAB显色CK-pan
AEC显色CD30
5、抗体的选择
需要考虑的因素： 选择合适的抗体组。 如果同时有多种抗体可供选择，确 定其中一种（此选择至关重要，因为 许多抗体可能不敏感或不特异）。 费用。 市售已稀释抗体不一定是最佳浓度（事实 上常需根据抗原修复法的不同来确定）
CD20
CD20
肿瘤诊断
胃肠道间质肿瘤分类 胃肠道间质肿瘤：最常见的表型:*ckit(CD117 )+ 、 CD34+ 、 actin- 、 desmin 平滑肌肿瘤：c-kit- 、 actin+ 、 desmin+ 雪旺氏瘤：c-kit- 、 actin- 、 desmin- 、 S-100+
一 免疫组织化学在外科源自文库理诊断中的应用
在当今的外科病理诊断 中极其重要，可以和过 去常规工作中的特染 （如PAS）相媲美。 免疫组化的应用使得一 些特染方法（如PATH） 不再被使用。
免疫组织化学在外科病理诊断中的应用
免疫组织化学发挥重要作用 的前提是相应的实验室能提 供稳定与高质量的免疫染色 结果 否则会导致误诊
肿瘤诊断
浆膜腔活检或积液诊断中的难题： 反应性间皮细胞还是腺癌？ 腺癌还是间皮瘤？ 最好的间皮细胞标记物： Calretinin 鉴别诊断中最好的腺癌标记物： BerEP4 、 CEA。
CEA
CEA
肿瘤诊断
神经内分泌肿瘤的分类 诊断神经内分泌肿瘤必须有明确的 全神经内分泌标记物阳性：Syn和或CgA。
NSE缺乏特异性，没有意义。 区分类癌与副神经节瘤：前者 Cytokeratin +，后者可见S-100+的支持细 胞。
Syn
Syn
肿瘤诊断
内分泌肿瘤的分类 检测肿瘤分泌激素 胰岛细胞瘤：分泌胰岛素的肿瘤很 少为恶性，而分泌胃泌素或胰高血糖素 的肿瘤常为恶性。 垂体腺瘤：高催乳素血症是由催乳 素瘤还是其它刺激催乳素分泌的肿瘤引 起？
免疫组化结果的评定
确保染色部位系所用抗体固有，如多 数白细胞标记，c-erbB2、CA125为细 胞膜阳性；ER、PR、S-100、TdT为细 胞核阳性。 如果染色部位不对，不应判定为阳性 结果（如c-erbB2 胞浆阳性）。
二、免疫组化在诊断中的应用
肿瘤诊断 判定癌的可能起源 癌症的预后因子 证实感染 宫内孕的诊断 其它 ……
免疫组化染色中的注意事项
免疫组化如此重要，因此在 操作中要十分仔细并需要可 靠的对照系统保证其质量。 错误诊断以及操作失误或错 误判断均可能会导致医疗纠 纷。
一、免疫组化相关技术
组织固定与选择 抗原修复 检测系统 显色原的选择 抗体的选择 对照的使用 标准化与自动化
1、组织固定
福尔马林缓冲液是最好的常用固定液：组织形态保 存好，抗原保存好。 其它如含酸或含汞固定液，抗原保存效果不稳定。 目前我们科使用“AF”液(混合性固定液：福尔马林、 酒精、醋酸），效果好。
判定腺癌原发部位的免疫组化标记物
CA125：阳性表达提示女性生殖道起源 （偶尔肺、乳腺、胰管胆管 癌可呈阳性 表达） BREAT-2（GCDFP-15）：50%乳腺癌阳性
甲状腺球蛋白：甲状腺起源
PSA：前列腺起源
判定鳞（样）癌原发部位的免疫组化标记物
2、判定肿瘤起源
形态特征 淋巴上皮瘤样：NPC 透明细胞被纤细血管分隔：肾 小梁状或窦样结构：肝 乳头和核沟：甲状腺（PTC）
形态学仍是最重要的判定依据！
判定肿瘤起源
形态特征 多量印戒细胞：胃 印戒细胞无粘液：前列腺 实性团块生长但核级别低（尤其核仁 明显）：前列腺 腺体呈花环状、腺腔内有脏的碎片:肠 顶浆分泌样胞浆：乳腺
3、检测系统
目前多数实验室使用SP或ABC或LSAB检测 系统 ：对多数抗体足够有效和敏感。 当前趋势：在连接时使用多价生物素化 的免疫球蛋白（如抗-兔、抗-鼠混合 物），这样不管一抗是单克隆还是多克 隆，可以使用同一种试剂，从而避免 （人为）用错试剂。
En Vision 系统
采用葡聚糖连接技术。 步骤简单（显色前仅2步），避免内源 性生物素干扰。 据厂商及一些研究称：高度敏感（接近 tyramide 系统）。 目前国内运用情况及个人体会：此系统 并不令人十分满意！（尤其是碱性磷酸 酶系统）。
肿瘤诊断
软组织肿瘤分类（标记物非常有限） 纤维组织细胞瘤没有可靠的标记物 S-100：神经鞘瘤 EMA：周围神经细胞瘤、滑膜肉瘤 Actin 、 desmin：肌源性肿瘤 Cytokeratin：滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、 横纹肌样瘤
肿瘤诊断
软组织肿瘤分类 CD31：血管肿瘤 CD34：血管肿瘤、孤立性纤维瘤、 DFSP 、血管周细胞瘤、梭形细胞 脂肪瘤 Syn： PNET CD99：尤文氏肉瘤/PNET
影响免疫组化重要性的因素
高效抗原修复系统（甚至适用于不同的组织固定与 制片方法） 高度敏感的检测系统 大量能应用于常规石蜡切片的抗体
约5-10%的标本需要进行免疫组化染色
免疫组织化学：省钱还是费钱？
尽管免疫组化染色意味着抗体、 相关系统及人力方面的支出， 但由于它从整体上节省了医疗 费用，因此这笔支出非常值得.
肿瘤诊断
原位病变/良性病变还是恶性 Actin可以清晰地显示乳腺的肌上皮 细胞。 乳头状瘤与导管内乳头状癌； 硬化性腺病与管状腺癌； 导管内癌是否有浸润性成分？ 导管内癌导致的硬化性腺病还 是真正的浸润性癌？
CKAE3
肿瘤诊断
是否为肝细胞癌？ 诊断概要：肝细胞癌还是腺癌 （原发/转移）？ 传统上，CAM5.2+ 、 AE1/AE3-免疫 表型或CEA呈小管状阳性被用做肝细胞 癌的诊断依据。
免疫组化是如何节省医疗保健费用的
破碎或微量标本：使得诊断成为可能，避免了重复活 检。 可以对恶性肿瘤的分化程度及临床分期进行更为准确 的评估，有助于选择最有效的治疗方法。
免疫组化是如何节省医疗保健费用的
使得肿瘤在可治愈性较大的阶段时得到早期诊断。 帮助确定转移性或不知原发部位肿瘤的原发灶， 节省了时间和财力。
3、判定癌瘤原发部位的免疫组化标记物
器官特异性标记物： 甲状腺球蛋白：甲状腺 降钙素：甲状腺 PSA或PAP：前列腺 表面活性物质：肺 BRST-2/GCDFP-15：乳腺 HEP-PAR1：肝
判定腺癌原发部位的免疫组化标记物
CK7：除胃肠道外，大多数腺癌均为阳性 表达 CK20：仅胃肠道 和女性生殖道腺癌、粘 液腺癌为阳性表达。 PE-10（表面活性物质）：50%肺腺癌阳性 TTF-1（甲状腺转录因子-1）：80%以上肺 腺癌阳性