基因组DNA测序文库构建

基因组DNA测序文库构建
1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含
RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。

对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。

对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。

2.用Qubit检测DNA样品浓度。

3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，
体积为130ul。

用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。

4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。

5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul
TE或Elution Buffer洗脱。

回收产物用Qubit测值。

6.修平和磷酸化
100ul体系
DNA 1ug
5 X T4 polymerase buffer 20ul
BSA (5mg/ml) 2ul
ATP (100mm) 1ul
dNTP（10mm）10ul
T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul
Klenow（10U/ul）1ul
T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul
22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。

纯化后Qubit测值。

7.加‘A’
100ul体系
DNA 0.5-2.5ug
10 X klenow buffer 10ul
dATP(10mm) 1-3ul
Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul
37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。

纯化后Qubit测值。

8.连接头
200ul体系
10 X T4 DNA ligase buffer 20ul
PEG4000 30ul
ATP(100mm) 2ul
DNA X
接头 Y
T4 DNA ligase 1.5-2ul
加水至 200ul
DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。

9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。

10.PCR扩增
10 X TagE buffer 5ul
Mg2+ 4ul
dNTP(10mm) 1ul
lib-PCR-F 0.5ul
lib-PCR-R 0.5ul
tagE 0.5ul
DNA 5ul
ddH2O 33.5ul
11.琼脂糖胶回收。

12.Qubit测值，总量足够的情况下，取3ul跑胶检测。

13.附录
T4 DNA Polymerase由于同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。

T4 DNA Polymerase的3'→5'DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA 中的非配对链部分更容易被T4 DNA Polymerase所消化。

T4 DNA Polymerase的3'→5'外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。

DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) 是 E. coli DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，具有 DNA 聚合酶活性和3' →5' 核酸外切酶活性，但缺失了5' →3' 核酸外切酶活性。

Klenow 既保留了全酶的高保真性，又不会降解 DNA 5' 末端。

注意：由于该酶具有3' →5' 核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入 dNTP 或反应时间过长均会导致 DNA 末端碱基被切除形成凹陷。

T4 多聚核苷酸激酶能够催化磷酸在 ATP 的γ-位和寡核苷酸链 (双链或单链DNA 或 RNA) 的 5′-羟基末端以及 3′-单磷酸核苷间进行转移和交换，1 个Richardson 单位，指 37℃条件下，30 分钟内1 U催化 1 nmol 酸不溶性 [32P] 掺入所需要的酶量。

Klenow 片段（3´→5´exo- ）是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。

它保留了 DNA 聚合酶活性，但失去了5´→3´ 外切核酸酶活性。

该酶经突变（D355A, E357A）去除了其3´→5´ 的外切核酸酶活性(1) 。

1 单位指在37°C条件下，30 分钟内能使
10 nmol 的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

注意：Klenow 片段（3´→5´exo
-）因去除了3´→ 5´ 外切酶的活性，故不适宜用于生成平末端的反应。

当用于双脱氧法 DNA 序列测定时(3) ，建议用 1 unit/5 μl 反应体系。