无菌检验方法适用性试验方案

无菌检验方法适用性试验方案

目录

1.概述

1.1试验背景

为保证无菌检验结果的准确可靠，当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的适用性试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于该产品的无菌检查。按照《中国药典》2015年版四部“通则1101无菌检查法”要求，检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，检查方法应进行重新试验。

根据2015年版药典及药品微生物实验室质量管理指导原则要求，检测环境由原来的为C级背景下局部A级空气单向流，在层流净化工作台下进行无菌检测，变更为在C级背景下，无菌检查ORABS隔离系统中进行无菌检测,且由原来的臭氧消毒，变更为臭氧+过氧化氢灭菌消毒；培养基发生变更：由培养真菌用的改良马丁培养基变更为胰酪大豆胨液体培养基，培养温度由23-28℃变更为20-25℃，现针对XXX注射液进行适用性试验，以证明所采用的方法适合该药品的无菌检查。

1.4方案说明

验证过程中严格按照经批准的方案规定的内容进行，若因特殊原因需要变更时，应填写方案变更申请及批准书，报试验领导小组批准。

2.确认目的

按照《中国药典》2015年版四部“通则1101无菌检查法”规定对小儿氨基酸注射液无菌检查方法进行试验，在现有检验程序、检测条件及培养条件下，对该供试品的适用性试验进行确认，证明所采用的方法适合该药品的无菌检查。

验证过程中应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证领导小组批准。

3.小组人员

4.风险评估

4.1风险等级标准

A.严重程度（S）：测定风险的潜在后果，分为以下四级：

B.可能性程度(P)：测定风险产生的可能性，为建立统一基线，建立以下四个等级：

C.检测能力（D）：在潜在风险造成危害前，检测发现的可能性，设为以下四个等级：

风险分析及评价：根据确定的风险标准对已经识别并分析的风险进行评价，即通过评价风险的严重性和可能性从而确认风险的等级。

质量风险优先级别评价标准如下：

风险优先系数（RPN）计算：严重程度（S）×可能性程度(P)×检测能力（D）。

风险水平的划分：

① RPN>16 或严重程度=4

高风险水平：此为不可接受风险。必须尽快采用控制措施，通过提高可检测性及/或降低风险产生的可能性来降低最终风险水平。验证应首先集中于确认已采用控制措施且持续执行。由严重程度为4 导致的高风险水平，必须将其降低至RPN 最大=8。

②16≥RPN≥8

中等风险水平：此风险要求采用控制措施，通过提高可检测性及/或降低风险产生的可能性来降低最终风险水平。所采用的措施可以是规程或技术措施，但均应经过验证。

③RPN≤7

低风险水平：此风险水平为可接受，无需采用额外的控制措施。

4.2风险的确认

无菌检查结果不成立

4.3 风险的分析及评价

4.4依据风险分析及评价结果需实施的确认项目

5.试验前准备

5.1文件确认

检查人：检查日期：

复核人：复核日期：

5.2.仪器确认：

5.2.1确认检测设备已经检定并在有效期内使用。

5.2.2确认检测设备运行良好，且满足检测需要。

检查人：检查日期：复核人：复核日期：5.3物料、培养基和冲洗液的确认

5.3.1确认物料、培养基是否在有效期内使用

5.3.2确认物料、培养基储存条件、性状符合要求。

5.3预培养及灵敏度实验检查

5.3.1确认培养基已经预培养实验，并预培养合格。

5.3.2确认培养基已经灵敏度试验检查，并合格。

5.4菌种确认：

5.4.1确认菌种有效期在合格范围内。

6.菌液制备

6.1.接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35°C培养18〜2 4小时；取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌斜面菌苔至3mlXXX注射液中混匀，取1ml至空比浊管与标准比浊管比浊，以至即为100。取100菌液1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，做为10-1稀释液，依次稀释至10-8。取10-5~10-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级作为试验菌液。

6.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35°C培养18〜2 4小时后，取上述培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，做为10-1稀释级，依次稀释至10-8。取10-5~10-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级作为试验菌液。

6.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，

20〜25°C培养24〜4 8小时，上述培养物用0. 9%无菌氣化钠溶液制成每lm l含菌数小于lOOcfu(菌落形成单位）的菌悬液。取上述培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，做为10-1稀释级，依次稀释至10-8。取10-5~10-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级作为试验菌液。

6.4接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25°C培养5〜7 天，加人3〜5m l含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0. 9 %无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用管口带有能过滤菌丝的装置（如薄的无菌棉花或纱布的无菌毛细吸管）吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (m l/m l)聚山梨醋80的0. 9 % 无菌氯化钠溶液加入0.9%无菌氯化钠溶液中，作为10-1稀释级。依次稀释至10-8。取10-4~10-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu/ml的稀释级作为试验菌液。

6.4.1.计数结果

取上述各稀释级各种菌悬液或孢子悬液1ml，分别用融化后45℃左右的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基15ml～20ml注皿，各平行测定两皿。胰酪大豆胨琼脂培养基在30～35℃培养48小时，沙氏葡萄糖琼脂培养基在20～25℃培养72小时，计数l。

表1 平皿计数法，各对照菌菌落计数结果，单位：cfu/ml

6.5正式试验

6.5.1样品信息：