产蛋白酶的菌株初筛

产蛋白酶的菌株初筛

吴建新温俊国王文

(山西大学环境与资源学院）

摘要：探究胞外蛋白酶的初步筛选方法和找到相对应的产蛋白酶的菌株。取养鸡场的鸡粪，采用含脱脂奶粉的菌种筛选培养基和梯度稀释法涂布培养基，接不同浓度的菌种于培

养基中并且设置阳性对照。鸡粪中含有产蛋白酶的菌种，且在浓度为4

10-中菌种分布较好，3

10-较多，5

10-较纯。利用含脱脂奶粉的筛选培养基中可以初筛到鸡粪中的产蛋白酶菌株。

关键词：细菌；初筛；鸡粪；产蛋白酶

The production of protease by strain screening

Sharui Ma jiangbo Meng fanjian Sun xiaofei

(College of resource and environment, Shanxi University)

Abstract: Objective To explore the preliminary screening method of extracellular protease and find corresponding protease producing strains. Methods The farm manure, with skim milk screening culture medium and the gradient dilution coating medium with different concentrations of bacteria, to cultivate the positive control and set the medium. The results of chicken manure containing protease producing strains, and4

10-the concentration of species distribution better, 3

10-more, 5

10-more pure. Conclusion Screening using skim milk medium screening to the protease producing bacteria in chicken feces.

Keywords: bacteria; screening; chicken; protease

蛋白酶是催化肽键水解的一类酶,是一种重要的酶制剂,蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子

中一定的肽键，有专一性，因此，在食品、洗涤、医药、制革等工业中用途非常广泛)1(。

碱性蛋白酶是蛋白酶中应用较多的一类，在轻工、食品、医药工业中用途十分广泛，其

分布于动物、植物及微生物)2(。碱性蛋白酶最早发现于猪胰脏中，是一类最适pH偏碱性、适于在碱性条件下水解蛋白质的酶类。今年来工业产酶微生物，在洗涤、制革、食

品等行业得到了广泛的应用)4

3(-。本实验对

鸡粪中常温下产蛋白酶细菌的筛选方法，筛选出何种梯度稀释下菌落生长和分布的较好，为进一步复筛高产碱性蛋白酶提供合适的菌种。

1材料和方法)2( 1. 1材料1. 1. 1土样本实验所用含有鸡粪的土样来源于太原养鸡场。

1. 1. 2培养基普通肉汤蛋白胨培养基：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g Nacl 5g 琼脂18g

水1000ml pH 7.0—7.2 121度灭菌20min 脱脂奶粉用无菌水溶解后在0.06MPa下灭菌30min，制成15%的牛奶

1. 2方法

1. 2. 1 牛奶平板：脱脂牛奶用水溶解为15%的后单独灭菌，再铺平板时，取22.2ml 的灭菌牛奶与加热熔化的200ml普通肉汤蛋白胨培养基混合使其变为终质量为 1.5%的牛奶。

1. 2. 2 制备土样稀释液：称取土样10g。放入盛90mL的无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震荡约20min，使土样与水充分混合，使细胞分散。用一支无菌水移液管吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，

1. 2. 3 对照组：在其中的两个培养基的平板底部或培养皿盖周边用记号笔分别写上对照一和对照二。利用无菌操作技术，用接种环在地衣的培养基中取菌后均匀的接种出五个点于对照一的培养基中。在无菌操作技术下，在斜面试管培养基上用接种环轻轻的刮取几下，将2ml的无菌水倒入该试管中，制成菌悬液后，用无菌吸管吸取0.2ml 于对照二的培养基中央位置用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向︒

90沿另一垂直线来回推动，平板边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置5~10分钟。

盖周边用记号笔分别写上（1）3

10-，（2）3

10-，（1）4

10-，（2）4

10-，（3）4

10-，（4）4

10-，（1)5

10-和（2）5

10-这几种稀释字样。然后用无菌吸管分别有

4-

3-

2

110

10

10

10和

、

、-

-4管土壤稀释液中的吸取适量对号放入写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入0.2ml，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向︒

90沿另一垂直线来回推动，平板边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置5~10分钟。

1. 2. 4涂布：将上述每种培养基的平板底部或培养皿此为1

10-稀释液，以此类推制成

5

4

3

210

10

,

10

,

10-

-

-

-和几种稀释度的土壤溶液。

1. 2. 5 培养：将上述10个含有牛肉汤蛋白胨的培养基的平板倒置于恒温箱中培养24小时左右。

1. 2. 6 观察：24小时后，取出10个培养基，并用肉眼直接观察实验组与对照组的现象，并把有水解圈的实验组的菌落接种到培养基中，以备后面的复筛。

2 结果与讨论

2. 1产胞外蛋白酶菌株的初筛：

2个对照培养基中，利用5点接种环接种中其中5个菌落，有2个长出水解圈。利用菌悬液涂布的有130个菌落，有1个长出水解圈。8个实验培养基中，两个3

10-浓度的培养基中，189个菌落中没有水解圈的产生，另一个132个中有4个菌落长出了水解圈。在4个4

10-浓度的培养基中，其中一个100个菌落中没有水解圈的产生，一个112个菌落中有3个产生了水解圈，一个105个菌落中有2个产生了水解圈，最后一个100个菌落中有1个产生了水解圈。两个5

10-浓度的培养基中，有一个37个菌落中产生一个水解圈，另一个40个菌落中没有水解圈的产生。

2. 2实验组中产生水解圈的菌落的菌落直径和水解圈的大小表示