第四章 细胞破碎和分离技术

（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差； 缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率 不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
纳豆激酶
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士， 从事溶解血栓药物研究工作
“下午两点半”实验 下午两点半：纳豆提取物加入到人工 血栓中；
下午五点半：血栓溶解2厘米
纳豆的制作
1、泡豆蒸豆
大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。
2、接种纳豆菌
纳豆菌用热水溶解后，加入到大豆中，搅拌均匀，分装。
3、在恒温下发酵14-36小时 4、后熟（活菌低温休眠）
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 （2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（二）膨胀床分离技术
1、膨胀床的定义
（1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动， 流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到 某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床 层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被 流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床
（5）柱床的再生和清洗
原因：非特异性吸附污染
试剂：0.5-1mol/L的NaOH（常用）
方法：控制流速，使柱床膨胀5倍，清洗3小时
4、膨胀床的操作（5个步骤）
（1）平衡 （2）进料吸附
（3）洗涤
（4）洗脱
（5）柱床再生和清洗
5、膨胀床的应用
纳豆激酶的分离提取
纳豆：大豆经纳豆菌发酵而成
降血压，抗癌 抗氧化，溶血栓
（5）膨胀床与流化床的区别
流化床的填料和液体在床层内混合程度高，吸附效 率低，而膨胀床的填充颗粒基本悬浮于固定的位置， 液体的流动与固定床相似，接近平推流，吸附效率 高。
2、膨胀床装置
调节柱床高度
色 谱 柱
保证液体以平推流形式 流过柱子
3、膨胀床吸附剂
（1）吸附剂应具备的条件 ①吸附性能好 ②沉降速率高 ③吸附剂要在粒径和密度上有差异 ④有良好孔道结构，不易被污染
细胞碎片去除和产品纯化同步的方法
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶 琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系
（1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖；
（2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
通过流速控制膨胀率
（2）进料吸附
把目标产物吸附在吸附剂上，让杂质或细胞碎片等 固体颗粒流出膨胀床。
（3）洗涤
洗去留在柱内的细胞、细胞碎片和弱吸附性 的杂质。
洗涤结束后，改用固定床操作
（4）洗脱
采用固定床操作，将配制好的洗脱液用横流 泵从柱上部导入，下部流出，分段收集，并 分析检测目标产物的活性峰位置。
注意：破碎时要采取冷却措施
2、高压匀浆法
注意：团状或丝状真菌不适用
出料口
高压匀浆机 进料口
利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压 和高速冲撞造成细胞破裂
3、超声破碎法
原理：空化作用和搅拌作用
缺点：产生的热量不容易驱散，不适 于大规模操作，主要用于实验室。
不同机械破碎方法的比较
技术 原理
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
3、双水相体系分离细胞碎片 优点：设备简单，容易放大 缺点：规模放大时，成本增加
目标产物 细胞或细胞碎片 用PEG1500/NaH2PO4体系从 Trichoderma koningii发酵液中分离纯化 β - 木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下 相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。
（三）化学法（化学渗透法）
1、碱处理 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸 水 浴处 理 ，细 胞 吸 水 膨 胀 破 裂 。
。
成本
举例
珠磨法
固体剪切作用
便宜
适中 昂贵
大规模处理
大规模处理 小规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 超声波法 液体剪切作用
（二）物理法
1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞。
2、超临界CO2的破壁原理
CO2的临界值：31.26℃；7.38MPa 超临界CO2密度近于液体，粘度近于气体，扩 散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解 能力。 超临界CO2易于渗透到细胞内，突然降压后， 因细胞内外较大的压差而使细胞急剧膨胀而 破裂。
超临界
（一）机械法
（二）物理法
（三）化学法 （四）生物法 （五）超临界细胞破碎技术
（一）机械法
利用高压、研磨或超声波等手段使细胞受到挤 压，剪切和撞击作用 1、珠磨法 2、高压匀浆法 3、超声破碎法
1、珠磨法
珠磨法原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于 1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂与细 胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎， 释放出内含物。
（3）膨胀床
稳定的、返混很小的流化床，即所谓的膨胀床,它 既能比较容易地让细胞或细胞碎片通过填料层，又 能以填充床的模式来吸附目标产物。
（4）膨胀床与固定床的区别
膨胀床吸附技术
膨胀床的床层上部安装有可调节床层高度的调节 器，当料液从床底输入时，床层产生膨胀，高度 调节器上升，床层空隙增加，允许菌体细胞或细 胞碎片自由通过。因此，膨胀床吸附操作可直接 处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标 产物。 节省离心或过 滤等处理过程
第四章 细胞破碎和分离提 取技术
发酵液或培养液 预处理 固液分离（离心或过滤）
固体沉淀：胞内产物
细胞破碎和细胞碎片分离
清液：胞外产物
目标产物
本章内容
目标产物
一、细胞破碎的主要阻力：细胞壁
细胞破碎的主要目的：破坏细胞壁和细胞膜， 使细胞内物质释放出来。
各种微生物细胞壁组成与结构
二、常用细胞破碎技术及原理
（四）生物法 1、酶溶法
（1）原理：利用酶溶解细胞壁，使细胞壁受到部分 或完全破坏； （2）常用的酶：溶菌酶、 β-1 ,3-葡聚糖酶、
β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶等。
其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用 较显著。
溶菌酶：能直接水解G+菌细胞壁，作用位 点是肽聚糖多肽链中的β-1，4糖甘键。
发酵后，放在冰箱内低温熟成数小时，做好的纳 豆无论是外观还是口感都会更好。
（三）泡载分离技术
1、定义
又称泡沫分离或泡沫吸附分离，是以气泡为介 质，利用组分的表面活性差异进行分离的技术。
空气
2、原理
通过向溶液鼓泡形成泡沫层，表面活性物质 会聚集在泡沫层内，然后将泡沫层与液相主 体分离。
破沫器
泡沫 活性剂补充口 液体 泡沫液
比较项目 破碎机理 碎片大小 内含物释放 粘度 时间，效率 设备 通用性 经济 应用范围 机械法 切碎细胞 碎片细小 全部 高（核酸多） 时间短，效率高 需专用设备 强 成本低 工业规模，实验室 非机械法 溶解局部壁，膜 细胞碎片较大 部分 低（核酸少） 时间长，效率低 不需专用设备 差（专一性强） 成本高 实验室，部分工业
G+菌的细胞壁
G-菌的细胞壁
2、自溶法
通过调节温度、pH等诱导细胞产生溶解自身的酶。
45-50℃ 酵母 12-24h 自溶
（五）超临界细胞破碎技术
1、超临界流体
（1）临界温度：在温度高于某一数值时，任何大的 压力均不能使该物质由气相转化为液相，此时的温 度即被称之为临界温度； （2）临界压力：临界温度下，气体能被液化的最低 压力称为临界压力。 （3）超临界流体：指温度和压力处于临界条件之上 的流体。
表面活性剂：月桂酸或硬脂酰胺等
泡沫分离：1min除去90%细胞
10min除去99%细胞
思考题 1、名词解释
超临界流体 泡载分离技术
固定床
膨胀床
2、什么是固定床？流化床？膨胀床？并 简述它们之间的区别？
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
3、化学试剂法
（1）EDTA螯合法：导致外层膜不稳定或溶解
革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌
革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子 Ca2+ 或 Mg2+ 结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦 EDTA将Ca2+或Mg2+ 螯合，大量的脂多糖分子将脱 落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层 膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
（2）常用吸附剂
物理吸附，化学吸附 和离子交换吸附
多糖包埋石英砂，玻璃微球等。 如Streamline介质：在石英砂外表面包裹了一层 琼脂糖
琼脂糖上的功能基团可以被修 饰，提高目标产物的吸附容量
4、膨胀床的操作（5个步骤）
（1）平衡：用平衡缓冲液让膨胀床达到平衡，保持 一定的膨胀率。
膨胀2倍，吸附性能最好
气体
3、应用 （1）表面活性物质的分离纯化
如蛋白质，废水中的去污剂等
（2）能与表面活性物质结合的任何物质
如金属离子
如：环境领域
从工业污水如电镀废水、纺织废水中分离和回 收金属离子。
回收：废水溶液中的Cu2+ 表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS） 回收率：45.5%
例：生物工程领域（泡沫分离大肠杆菌）
三、选择破碎方法的依据
1、细胞的处理量 2、细胞壁的强度和结构 3、目标产物对破碎条件的敏感性 4、破碎程度 适宜的操作条件应有高的产物释放率，低 的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡
作业与思考题
1、简要说明常用的细胞破碎方法、原理及特点？
四、从发酵液直接分离产物
细胞破碎
目标产物
细胞碎片很小，很难用 过滤法除去。