实验二溶血空斑meng

【操作方法】 操作方法】
免疫动物 取2.5% 绵羊红细胞悬液2ml，无菌操作注射 于小鼠腹腔内。（4 天后追加一次免疫效果 更佳）。 见试验一，已做
制备脾细胞悬液
1. 将免疫后7 天的小鼠颈椎脱位处死，75% 乙醇浸泡 3 将免疫后7 天的小鼠颈椎脱位处死， 75%乙醇浸泡3 分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； 分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； 在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁， 2. 在小鼠左腹侧中部剪开小口 ， 撕开皮肤 ， 暴露腹壁 ， 可见红色长条状脾脏； 可见红色长条状脾脏； 3. 在脾脏下侧提起腹膜 ， 剪开后上翻 ， 暴露脾脏 ， 用 在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏， 镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织， 镊子提起脾脏 ， 眼科剪分离脾脏下面的结缔组织 ， 取出脾脏。放入盛有5 液的培养皿中； 取出脾脏。放入盛有5ml Hanks 液的培养皿中； 左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用5 4. 左手持一把小镊子夹住脾脏 ， 右手用 5ml 的注射器 抽取平皿内液体( ml)缓缓注入脾脏内 缓缓注入脾脏内， 抽取平皿内液体(4～５ml)缓缓注入脾脏内，将脾细 胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。 胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。
红细胞计数
Concentration/ml = (Dilution Factor)(Count in 5 squares X5)X 104
加样
10ul 细胞悬液
玻片小室的制作
取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5 取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm 和一条10 10mm 的双面胶， 和一条10mm 的双面胶，然后用小镊子取 二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室， 二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室， 用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。 用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。
眼球取血 → 处死小鼠 → 取脾→用10ml洗 取脾→ 10ml洗 液冲脾→离心2000r/min 8min→弃上清 弃上清， 液冲脾→离心2000r/min 8min→弃上清，加 裂解液2ml 混匀，2min后离心（转数、 裂解液2ml，混匀，2min后离心（转数、时间 2ml， 后离心 同上） 弃上清加洗液10ml 混匀， 10ml， 同上）→弃上清加洗液10ml，混匀，离心 同上） （同上） 弃上清加4.9ml 4.9ml洗液混匀 弃上清加4.9ml洗液混匀 取0.1ml脾细胞悬液+0.9ml洗液（A液），混 0.1ml脾细胞悬液+0.9ml洗液（ 脾细胞悬液+0.9ml洗液 ），混 匀 取0.1ml（A液）+ 0.1ml指示系统，混匀 0.1ml（ 0.1ml指示系统 指示系统， 取50ul加入玻片小室（约用30ul） 50ul加入玻片小室（约用30ul 30ul） 加入玻片小室
【试剂与器材】 试剂与器材】
健康小鼠（ 18～ 克重）。 1. 健康小鼠（约18～20 克重）。 绵羊红细胞悬液（2.5%）。 2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）。 3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液 指示细胞悬液： 0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml， 0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml， 2.0ml。 Hank′s 液2.0ml。 pH7.2）。 4. Hank′s 液（pH7.2）。 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、 ）、平皿 5. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、 盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。 6. 盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。
细胞混悬液的配制及灌注
1.取小试管一支， 1ml吸管取0.2ml指示 1.取小试管一支，用1ml吸管取0.2ml指示 取小试管一支 吸管取0.2ml 细胞悬液； 500倍稀释的脾细胞 细胞悬液；0.2ml 500倍稀释的脾细胞 悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。 悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。 2.用100μl的微量进样器吸取被检细胞混 2.用100μl的微量进样器吸取被检细胞混 合悬液， 合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两 个小室。记录实际注入的悬液微升数。 个小室。记录实际注入的悬液微升数。 将做好的标本水平放置37℃温箱中， 37℃温箱中 3. 将做好的标本水平放置37℃温箱中， 孵育30 孵育30 分。
【结果分析】 结果分析】
结果观察及溶血空斑计数。 结果观察及溶血空斑计数。 1.肉眼观察空斑 1.肉眼观察空斑 ，计数两个小室出现的溶血空 斑数。对模糊不清的空斑， 斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检 真正的溶血空斑， 查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴 细胞，周围为透明区。 细胞，周围为透明区。 2.计算出全脾脏中抗体产生细胞总数 计算出全脾脏中抗体产生细胞总数： 2.计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：
脾细胞悬液总毫升数（即为50ml） 脾细胞悬液总毫升数（即为50ml） 50ml 抗体产生细胞总数＝ 抗体产生细胞总数＝ 注入小室内的脾细胞毫升数 ×标本出现的空斑数
溶血空斑试验现象
小鼠B 小鼠B细胞溶血空斑形成试验
溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活 化补体， 化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细 胞的一种体外试验方法， 胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于 检查动物的抗体产生功能。 检查动物的抗体产生功能。 将绵羊红细胞（SRBC） 将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞 制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合， 制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合， 在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC 在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC 溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。 溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要 用于测定B细胞抗体产生能力。 用于测定B细胞抗体产生能力。
实验二
血清分离（眼球取血） 血清分离（眼球取血） 脾细胞制备(吹气球法) 脾细胞制备(吹气球法) 溶血空斑试验
血清分离Hale Waihona Puke Baidu
眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在 眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤， 实验台上，取侧卧位， 实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠 眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。 眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯 镊迅速夹去眼球，将鼠倒立， 镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流 出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。 出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。 每次采血量0.6 0.1mL。 0.6每次采血量0.6-0.1mL。
【操作方法】 操作方法】
眼球采血将血液保存于1.5mlEp管中， 眼球采血将血液保存于1.5mlEp管中， 1.5mlEp管中 ℃静置 静置24H 10000rpm/10min，收集血清； 4 ℃静置24H 10000rpm/10min，收集血清； 20℃保存待抗体水平检测 保存待抗体水平检测。 -20℃保存待抗体水平检测。同时采集正常小 鼠血清作为对照。 鼠血清作为对照。
细胞计数板（Hemacytometer） 细胞计数板（Hemacytometer）
血球计数板，通常是一块特制的载玻片， 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上 由四条槽构成三个平台。 由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短 横槽隔成两半， 横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方 格网，每个方格网共分九个大方格， 格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大 方格即为计数室， 方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中 进行。 进行。 计数室的刻度一般有两种规格， 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大 方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25 16个中方格 方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25 个小方格；另一种是一个大方格分成25 25个中方 个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方 而每个中方格又分成16个小方格。 16个小方格 格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论 是哪种规格的计数板， 是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方 格数都是相同的， 16×25=400小方格 小方格。 格数都是相同的，即16×25=400小方格。
5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中， 5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再 用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中 用少量Hank′s 用少量Hank′s 液冲洗脾脏及平皿内残留的 细胞，移入试管内。离心1000 细胞，移入试管内。离心1000 转/分5～ 10 弃上清， 冷红细胞裂解液（ 分, 弃上清，加5ml 冷红细胞裂解液（NH4Cl 双蒸水+Tris 3.735g/450ml 双蒸水+Tris 1.3g/50ml 双蒸 pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中， ），将细胞离心管插入碎冰中 水pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每2 分钟摇动1 裂解10 离心（1000转 分钟摇动1 次，裂解10 分。离心（1000转/ 弃上清， 液洗2 分）5～10 分。弃上清，用Hank′s 液洗2 离心（ 10分钟 弃上清。 分钟。 次，离心（1000 转/分）5～10分钟。弃上清。 Hanks悬浮细胞 调细胞浓度到2 悬浮细胞， /m1。 用Hanks悬浮细胞，调细胞浓度到2×l06/m1。 6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀 将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。 6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。 吸取此悬液0.1ml 放小试管中，再加 吸取此悬液0.1ml 放小试管中， 即为500 0.9mlHank′s 液，即为500 倍稀释的脾细胞 悬液。 悬液。
示意图
细胞计数板的使用
1mm
A
1mm B
1ml=1cm3=1000mm3
A+B+C+D 细胞数= 细胞数 4 C D × 104 ×稀释倍数 稀释倍数
Concentration/ml = (Dilution Factor)(Count in 4 squares/4) X 104 A+B+C+D 细胞数= 细胞数 4 × 104 × 稀释倍数