注射液无菌检查的方法学验证方案

注射液无菌检查方法（中国药典2010版）验证方案验证方案编号：2010•MEF•041•05•004

起草单位(Composed by)：质检部(QC Department)

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审核人(Reviewed by QA)：日期(Date)：

批准人(Approved by)：日期(Date)：

目录

1. 验证目的

2. 验证人员

3. 验证依据及参考文件

4. 仪器与设备

5. 验证过程

5.1 培养基及稀释液5.2 菌液的培养与制备

5.3 方法验证试验

6. 验证总结

1. 验证目的：

本试验是注射液的抑细菌、抑真菌活性及所用的无菌检查方法的可靠性进行验证，以确认该产品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可以忽略。即：保证所用的无菌检验方法能对该产品进行准确、可靠的检验。

2. 验证人员：

验证小组组长：刘长宏

验证小组副组长：宋芳良

验证小组成员：曲晓燕、常西胜

3. 验证依据及参考文件：

验证依据：中华人民共和国药典2010版二部

参考文件：2010年版中国药典无菌检查方法、验证操作学习班讲稿汇编（中国药品检验所）

4. 仪器与设备

XG1.DM-0.36B型机动门脉冲真空灭菌器

细菌培养箱

霉菌培养箱

净化工作台

5. 验证过程：

5.1 培养基及稀释液

5.1.1 培养基及稀释液的配制

按“中国药典2010版二部附录Ⅺ H无菌检查法”中，有关规定配制本验证所需培养基:

5.1.2培养基的适用性检验

5.1.2.1 培养基无菌性检查

从以上培养基及稀释液中，每批随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。

结果记录：

结论：

5.1.2.2 培养基灵敏度检查

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，逐日观察结果。

取每支装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。

空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则可判该培养基的灵敏度检查符合规定。

较差记为“差”。

记为“差”。

结论：

5.2 菌液的培养与制备

5.2.1 菌种

5.2.2菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时。用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。取肉汤培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7稀释级可得约为50～100cfu/ml的菌悬液。用营养琼脂培养基做活菌计数备用。

接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时。用0.9％无菌NaCl溶液稀释至10－5～10－7稀释级制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23~28℃培养24~48小时。用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。取改良马丁培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7稀释级可得约为50～100cfu/ml的菌悬液。用改良马丁琼脂培养基做活菌计数备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。取培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液（含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80）十倍稀释至10－4稀释级可得约为50～100cfu/ml的孢子悬液。用改良马丁琼脂培养基做活菌计数备用。菌液制备后在常温下放置，并在2小时内使用。若保存在2-8℃，可在24小时使用。

结论：

5.3 方法验证试验

按中国药典2010版二部规定，根据下表中预定检验方案，将规定量的注射液供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中分别加入小于100cfu 的试验菌之一，过滤。取出滤膜接种至相应培养基中（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种于硫乙醇酸盐流体培养基中；白色念珠菌、黑曲霉接种于改良马丁培养基中）。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量的相应试验菌，作为对照。按规定温度培养3～5天，观察各试验管生长情况。各试验菌同法操作。

与对照管（只加阳性菌）相比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则该供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可以照此检查法进行该产品的日常无菌检查。

如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则该供试品的该检验量在该试验条件下有抑菌作用，可逐一采用以下方法消除或减小该供试品的抑菌性并重新进行方法验证：

（1）增加冲洗量

（2）增加培养基的用量

（3）使用中和剂或灭活剂

（4）更换滤膜品种

同法每个注射液产品至少平行测定三次。

结论：6. 验证总结：