组织培养技术1
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硕士研究生选修课程系列
细胞培养技术
Cell culture
Department of medical microbiology of HMU 2010年9月
细胞培养技术
绪 论
2
体外培养
组织培养
in vitro
Tissue culture
细胞培养
Cell culture
器官培养
Organ culture
使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2
毫米）
4
细胞培养
Cell Culture
用相似方法体外培养单个细胞或单一细胞群，在
适宜条件下生长并保持细胞特性，为细胞培养。
组织培养 细胞培养
单一类型细胞
“组织特性”
人工环境
生存环境改变 细胞移动 长时间，反复传代
5
器官培养
Organ Culture
去分化可能是基因变异所致。
44
体外培养细胞有分化潜能
脊髓细胞来源中枢和遗传性状的不同，很 多细胞有一定程度的分化表达现象。 如毛细血管内皮细胞在初代培养和接种在 类似基膜物质底物上时，可形成类似血管样 结构。说明与体内条件越近似，细胞越易发 生分化。
细胞离体培养时间越长，分化能力越差， 在体外生存时间与其分化能力成反向关系。
低等生物到高等动物及人类细胞； 胚胎到成体； 正常组织到肿瘤细胞。 4. 便于使用不同方法研究细胞 ：
相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜；
组织化学法、免疫法和同位素标记等。
36
5. 易于施加物理、化学和生物因素进行实验
6. 培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组， 也是分子生物学和基因工程学的研究对象。 7. 可同时提供大量生物性状相似的实验对象， 耗资少，经济。 8. 已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗 体生产的必要手段
各种液体要专人配制，并保证做到按规程 行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制 备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上 名称、浓度、消毒与否和制备日期。
33
培养用品要固定存放：培养与非培养
用品存放分开；已消毒与未消毒用品 严格分开
目的：避免各种杂质混入细胞生存环
境、防止微生物感染和细胞“污染”。
10
细胞周期(cell cycle)：
DNA复制、细胞增殖过程。细胞从前一次分裂结
束开始至本次分裂终了所经历的时相过程，细胞 生长的过程有分裂期和分裂间期组成。
The four successive phases of a standard eucaryotic cell cycle
11
细胞污染：不同细胞之间因操作不严造成的相
互混杂，使细胞群体不纯的现象。
34
四、组织培养优缺点
优点：
1. 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活
动 ；
2. 可用于病毒学、细胞学、遗传学、免疫学、实
验医学和肿瘤学等学科的研究。
3. 便于观察、记录、摄影 ，直接观察细胞变化。
35
3. 可供研究的细胞种类广泛：
体外恶性转化（in vitro malignant
transformation）
细胞在体外培养过程中获得了致瘤性转化，当
把这种转化细胞接种于适当的动物后可产生肿 瘤。
25
二、发展史
德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培 养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的 萌芽试验。
1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈 白细胞生活一月，提示组织或细胞离体后， 在人工培养条件下，仍能生存。
应用与组织培养相似的条件，培养器官
的原基、器官的一部分或整个器官，使 之在体外生存、生长和保持一定功能的 方法。
使用器官原基或器官的一部分或整个器
宫
6
体外培养种类
7
概念
细胞融合（cell fusion）：
在体外培养条件下，经化学融合剂、病毒或物
理方法等诱发，使不同种的体细胞融合产生一 个细胞。
传代培养（passage）
将细胞从一个培养器皿中转移或移植到
另一个培养器皿中。
13
单层细胞培养（monolayer culture）
培养细胞有贴壁依赖性，在底物上平铺
长成单层细胞。
14
接触抑制(contact inhibition)：
贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相
互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S 期，也不会出现交叉重叠生长。
成神经细胞瘤 C1300
3. 培养细胞形态分类
贴附型
能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈 贴附性生长；只依赖于贴附才能生长。 贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象 常不显著。在形态上表现单一化的现象，并常 反应其胚层起源，呈现类似“返祖现象”。
成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多
能反复进行传代的细胞系。如传代细胞 系，HeLa细胞。
21
干细胞（stem cell）
来源于胚胎、胎儿或 成体中未分化的具有 继续分化潜能的细胞
胚胎干细胞指来自胚 胎期桑椹胚的卵裂球 或胚泡的内细胞团， 具有自我更新能力和 多能性。
22
细胞凋亡（apoptosis）
由体内外因素触发细胞内死亡程序开启而导致的细胞
26
1907年Harrison创建了凹窝玻璃悬滴培养 法，无菌条件下，用淋巴液作培养基，培 养蛙胚神经组织活数周，并观察到神经细 胞突起的生长过程。建立了体外培养组织 和细胞的基本模式。 1923年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩 大了组织的生存空间。
27
1924年 Maximow的双盖 片培养法，使之 更易于传代和减 少污染。
形型细胞
48
成纤维型细胞：
细胞体呈梭形或三角形，
卵圆形核，胞质伸出2-3
个长短不同的突起。
细胞多呈放射状、火焰状
或漩涡状走行。
包括成纤维细胞，中胚层
细胞培养类型
间充质起源组织（心肌、 平滑肌、成骨细胞、血管 内皮等）
49
31
三、实验者需要注意的问题
1. 严格掌握操作技术，理解各种操作的基本原理 2. 有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力
3. 熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性
状和相关的基本理论知识。
32
实验室管理制度
组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而严格的实验 性工作。 操作程序制定统一规则， 人员相对稳定和人人 遵守。
自杀过程，也称为程序性细胞死亡。
23
转染 （transfection）
用生物学或物理、
化学的方法将某细 胞的某个基因转移 到培养细胞核内的 一种实验手段。
24
体外转化（in vitro transformation）
细胞在体外培养过程中发生了与原代细胞形状
不同的转化，并可遗传变异，但不具有致瘤性。
动物细胞培养用容器及培养基
Culture vessels and medium for animal cell culture
3
一、基本概念
组织培养
tissue culture
，包括器官培养、组织培养和细
泛指体外培养
胞培养。
狭义是指从体内取出组织模拟体内生理环境，
在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生 存和生长并维持其结构和功能的方法。
37
局限性
组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环
境中，与体内环境相比，仍有很大差异。
实验结果不能完全代表体内，轻易做出与体内
等同的结论。
38
组织培养技术
第一章
组织培养基本理论知识
39
一、组织培养细胞生物学
40
1. 体内外细胞的差异
细胞在体外培养后，失去神经体液的调节和细
胞间的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，
化使机体结构和功能多样化，最终形成完整人体。
细胞的生命活动，是外源信号通过相关基因的调
控，使之发生增殖或分化的表达。 细胞离体培养后，信号来源切断，特定基因分化 表达减弱或停止。但进化中保守的细胞增殖活动可维 持；使体内外细胞出现了差异。
42
2. 培养细胞的分化
不适应 deadaption
细胞的分化特性减弱或不表现，如干细胞产生 酪氨酸转移酶的特性的丧失。
细胞一代时间(cell generation time)：
单个细胞两次连续分裂的时间间隔。如，
HeLa需24h，CHO细胞仅需12h。
代或世代（generation）
从细胞接种到下一次传代再培养的一段时
间。一般3-5天。
12
原代培养（primary culture）
从体内取出组织或细胞的第一次培养。
组织培养发展示意图
28
1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化处 理及液体培养基的方法，获得了的单层细 胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用 的技术。促进了细胞系(cell line)的建立。
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻 技术，各国建立细胞库
29
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国（黄祯祥）。
用单细胞分离培养或通过筛选的方法，
由单个细胞通过有丝分裂形成纯系的细 胞群 ，此过程称为细胞克隆。
建立的细胞系称为克隆细胞株，它们的
遗传特性相同。
Fra Baidu bibliotek
18
克隆形成率（cloning efficiency）
向底物接种单个细胞悬液，获得均一的 细胞集落的百分率，而且能肯定每个集 落的后裔细胞均起源于一个共同的祖细 胞。
45
体外培养时，细胞分化的表达形式变化
因环境的改变，细胞分化的表达形式也会发 生与体内不同的变化。
如二倍体成纤维细胞，在体外可传30-50代， 相当于150-300个细胞周期，最后衰老死亡，呈 现着生命发展分化过程。
阐明细胞分化机制意义
是了解癌变机理和攻克癌症的核心问题
培养细胞是研究分化最理想的实验对象。
细胞杂交(cell hybridization)
采用细胞融合方法2个或多个不同的细胞融合，
形成新的杂交细胞的过程。
8
9
细胞系(cell line)：
原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。
细胞株(cell strain)：
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞
系中获得的均一特殊性质或标志 并能稳定保持 这些特性的细胞群。
19
二倍体细胞系（diploid cell line）
具有两倍染色单体数目，既具有二倍体
核型的细胞系。
有限细胞系（finite cell line）
细胞系形成后仅能维持有限传代次数，
如二倍体细胞大约传50代。
20
连续（无限）细胞系
（continuous cell line）
具有无限繁殖能力，即获得了不死性，
15
悬浮培养（suspension culture）
细胞或细胞聚集体悬浮于培养液中增殖，
这些细胞无依赖于贴附底物或支持物上生 长的性质。
16
群体密度
（population density ）
培养皿内每单位面积或体积内的细胞数，
多用细胞数/cm² 表示或细胞数/mL表示。
17
细胞克隆(clone)：
主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越 长，分化改变越大；细胞刚离体培养时， 可 能不适应，即由于环境的改变而出现的变化。
生存条件的改变使分化发生阻抑；
43
去分化dedifferentiation
细胞失掉分化的能力 如肝脏细胞，当肝细胞失去产生精氨酸酶、
氨基转移酶等特性后，则失掉储存肝糖原能力， 并很难再现。
20世纪50年代起步
20世纪70年代，成为医学和生物学研究中 普遍应用的手段。
30
近30年来，建立了人和各种动物肿瘤及其 他细胞系，细胞库，细胞培养器皿，培养 基、血清、试剂等已商品化。 高科技使各种培养用具不断被引入，电镜 技术、标记技术、细胞分选技术、单细胞 显微注射、荧光免疫、电泳技术、杂交瘤 技术、DNA转染、细胞转化、分子杂交等 促进细胞培养技术发展。
必然发生变化 。
培养细胞最多见的表现是： 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不 显、出现类似“返祖现象”； 细胞趋向单一化，或获得不死性，或变成恶性 细胞群。
41
可能的机制：
体内细胞高度分化，细胞间有高度的相互依存性、 个体细胞相对失去独立性。从受精卵形成开始，细胞
有增殖和分化两个过程 。增殖使细胞数量增多，分
46
有分化特性的细胞系和细胞株
组织来源
脾 Morris肝癌 髓性白血病 垂体瘤 黑色素瘤 髓性白血病 胶质瘤
细胞系
Friend HTC K562 GH2,GH3 B16 HL60 CCM
增殖性
永生 永生 永生 永生 永生 永生 永生 永生
物种
小鼠 大鼠 人 大鼠 小鼠 人 人 大鼠
分化特性
合成血红蛋白 酪氨酸转移酶诱导 合成血红蛋白 产生生长激素 产生色素 合成球蛋白 胶质纤维酸性蛋白 生长轴突 47
细胞培养技术
Cell culture
Department of medical microbiology of HMU 2010年9月
细胞培养技术
绪 论
2
体外培养
组织培养
in vitro
Tissue culture
细胞培养
Cell culture
器官培养
Organ culture
使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2
毫米）
4
细胞培养
Cell Culture
用相似方法体外培养单个细胞或单一细胞群，在
适宜条件下生长并保持细胞特性，为细胞培养。
组织培养 细胞培养
单一类型细胞
“组织特性”
人工环境
生存环境改变 细胞移动 长时间，反复传代
5
器官培养
Organ Culture
去分化可能是基因变异所致。
44
体外培养细胞有分化潜能
脊髓细胞来源中枢和遗传性状的不同，很 多细胞有一定程度的分化表达现象。 如毛细血管内皮细胞在初代培养和接种在 类似基膜物质底物上时，可形成类似血管样 结构。说明与体内条件越近似，细胞越易发 生分化。
细胞离体培养时间越长，分化能力越差， 在体外生存时间与其分化能力成反向关系。
低等生物到高等动物及人类细胞； 胚胎到成体； 正常组织到肿瘤细胞。 4. 便于使用不同方法研究细胞 ：
相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜；
组织化学法、免疫法和同位素标记等。
36
5. 易于施加物理、化学和生物因素进行实验
6. 培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组， 也是分子生物学和基因工程学的研究对象。 7. 可同时提供大量生物性状相似的实验对象， 耗资少，经济。 8. 已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗 体生产的必要手段
各种液体要专人配制，并保证做到按规程 行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制 备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上 名称、浓度、消毒与否和制备日期。
33
培养用品要固定存放：培养与非培养
用品存放分开；已消毒与未消毒用品 严格分开
目的：避免各种杂质混入细胞生存环
境、防止微生物感染和细胞“污染”。
10
细胞周期(cell cycle)：
DNA复制、细胞增殖过程。细胞从前一次分裂结
束开始至本次分裂终了所经历的时相过程，细胞 生长的过程有分裂期和分裂间期组成。
The four successive phases of a standard eucaryotic cell cycle
11
细胞污染：不同细胞之间因操作不严造成的相
互混杂，使细胞群体不纯的现象。
34
四、组织培养优缺点
优点：
1. 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活
动 ；
2. 可用于病毒学、细胞学、遗传学、免疫学、实
验医学和肿瘤学等学科的研究。
3. 便于观察、记录、摄影 ，直接观察细胞变化。
35
3. 可供研究的细胞种类广泛：
体外恶性转化（in vitro malignant
transformation）
细胞在体外培养过程中获得了致瘤性转化，当
把这种转化细胞接种于适当的动物后可产生肿 瘤。
25
二、发展史
德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培 养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的 萌芽试验。
1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈 白细胞生活一月，提示组织或细胞离体后， 在人工培养条件下，仍能生存。
应用与组织培养相似的条件，培养器官
的原基、器官的一部分或整个器官，使 之在体外生存、生长和保持一定功能的 方法。
使用器官原基或器官的一部分或整个器
宫
6
体外培养种类
7
概念
细胞融合（cell fusion）：
在体外培养条件下，经化学融合剂、病毒或物
理方法等诱发，使不同种的体细胞融合产生一 个细胞。
传代培养（passage）
将细胞从一个培养器皿中转移或移植到
另一个培养器皿中。
13
单层细胞培养（monolayer culture）
培养细胞有贴壁依赖性，在底物上平铺
长成单层细胞。
14
接触抑制(contact inhibition)：
贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相
互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S 期，也不会出现交叉重叠生长。
成神经细胞瘤 C1300
3. 培养细胞形态分类
贴附型
能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈 贴附性生长；只依赖于贴附才能生长。 贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象 常不显著。在形态上表现单一化的现象，并常 反应其胚层起源，呈现类似“返祖现象”。
成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多
能反复进行传代的细胞系。如传代细胞 系，HeLa细胞。
21
干细胞（stem cell）
来源于胚胎、胎儿或 成体中未分化的具有 继续分化潜能的细胞
胚胎干细胞指来自胚 胎期桑椹胚的卵裂球 或胚泡的内细胞团， 具有自我更新能力和 多能性。
22
细胞凋亡（apoptosis）
由体内外因素触发细胞内死亡程序开启而导致的细胞
26
1907年Harrison创建了凹窝玻璃悬滴培养 法，无菌条件下，用淋巴液作培养基，培 养蛙胚神经组织活数周，并观察到神经细 胞突起的生长过程。建立了体外培养组织 和细胞的基本模式。 1923年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩 大了组织的生存空间。
27
1924年 Maximow的双盖 片培养法，使之 更易于传代和减 少污染。
形型细胞
48
成纤维型细胞：
细胞体呈梭形或三角形，
卵圆形核，胞质伸出2-3
个长短不同的突起。
细胞多呈放射状、火焰状
或漩涡状走行。
包括成纤维细胞，中胚层
细胞培养类型
间充质起源组织（心肌、 平滑肌、成骨细胞、血管 内皮等）
49
31
三、实验者需要注意的问题
1. 严格掌握操作技术，理解各种操作的基本原理 2. 有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力
3. 熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性
状和相关的基本理论知识。
32
实验室管理制度
组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而严格的实验 性工作。 操作程序制定统一规则， 人员相对稳定和人人 遵守。
自杀过程，也称为程序性细胞死亡。
23
转染 （transfection）
用生物学或物理、
化学的方法将某细 胞的某个基因转移 到培养细胞核内的 一种实验手段。
24
体外转化（in vitro transformation）
细胞在体外培养过程中发生了与原代细胞形状
不同的转化，并可遗传变异，但不具有致瘤性。
动物细胞培养用容器及培养基
Culture vessels and medium for animal cell culture
3
一、基本概念
组织培养
tissue culture
，包括器官培养、组织培养和细
泛指体外培养
胞培养。
狭义是指从体内取出组织模拟体内生理环境，
在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生 存和生长并维持其结构和功能的方法。
37
局限性
组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环
境中，与体内环境相比，仍有很大差异。
实验结果不能完全代表体内，轻易做出与体内
等同的结论。
38
组织培养技术
第一章
组织培养基本理论知识
39
一、组织培养细胞生物学
40
1. 体内外细胞的差异
细胞在体外培养后，失去神经体液的调节和细
胞间的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，
化使机体结构和功能多样化，最终形成完整人体。
细胞的生命活动，是外源信号通过相关基因的调
控，使之发生增殖或分化的表达。 细胞离体培养后，信号来源切断，特定基因分化 表达减弱或停止。但进化中保守的细胞增殖活动可维 持；使体内外细胞出现了差异。
42
2. 培养细胞的分化
不适应 deadaption
细胞的分化特性减弱或不表现，如干细胞产生 酪氨酸转移酶的特性的丧失。
细胞一代时间(cell generation time)：
单个细胞两次连续分裂的时间间隔。如，
HeLa需24h，CHO细胞仅需12h。
代或世代（generation）
从细胞接种到下一次传代再培养的一段时
间。一般3-5天。
12
原代培养（primary culture）
从体内取出组织或细胞的第一次培养。
组织培养发展示意图
28
1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化处 理及液体培养基的方法，获得了的单层细 胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用 的技术。促进了细胞系(cell line)的建立。
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻 技术，各国建立细胞库
29
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国（黄祯祥）。
用单细胞分离培养或通过筛选的方法，
由单个细胞通过有丝分裂形成纯系的细 胞群 ，此过程称为细胞克隆。
建立的细胞系称为克隆细胞株，它们的
遗传特性相同。
Fra Baidu bibliotek
18
克隆形成率（cloning efficiency）
向底物接种单个细胞悬液，获得均一的 细胞集落的百分率，而且能肯定每个集 落的后裔细胞均起源于一个共同的祖细 胞。
45
体外培养时，细胞分化的表达形式变化
因环境的改变，细胞分化的表达形式也会发 生与体内不同的变化。
如二倍体成纤维细胞，在体外可传30-50代， 相当于150-300个细胞周期，最后衰老死亡，呈 现着生命发展分化过程。
阐明细胞分化机制意义
是了解癌变机理和攻克癌症的核心问题
培养细胞是研究分化最理想的实验对象。
细胞杂交(cell hybridization)
采用细胞融合方法2个或多个不同的细胞融合，
形成新的杂交细胞的过程。
8
9
细胞系(cell line)：
原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。
细胞株(cell strain)：
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞
系中获得的均一特殊性质或标志 并能稳定保持 这些特性的细胞群。
19
二倍体细胞系（diploid cell line）
具有两倍染色单体数目，既具有二倍体
核型的细胞系。
有限细胞系（finite cell line）
细胞系形成后仅能维持有限传代次数，
如二倍体细胞大约传50代。
20
连续（无限）细胞系
（continuous cell line）
具有无限繁殖能力，即获得了不死性，
15
悬浮培养（suspension culture）
细胞或细胞聚集体悬浮于培养液中增殖，
这些细胞无依赖于贴附底物或支持物上生 长的性质。
16
群体密度
（population density ）
培养皿内每单位面积或体积内的细胞数，
多用细胞数/cm² 表示或细胞数/mL表示。
17
细胞克隆(clone)：
主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越 长，分化改变越大；细胞刚离体培养时， 可 能不适应，即由于环境的改变而出现的变化。
生存条件的改变使分化发生阻抑；
43
去分化dedifferentiation
细胞失掉分化的能力 如肝脏细胞，当肝细胞失去产生精氨酸酶、
氨基转移酶等特性后，则失掉储存肝糖原能力， 并很难再现。
20世纪50年代起步
20世纪70年代，成为医学和生物学研究中 普遍应用的手段。
30
近30年来，建立了人和各种动物肿瘤及其 他细胞系，细胞库，细胞培养器皿，培养 基、血清、试剂等已商品化。 高科技使各种培养用具不断被引入，电镜 技术、标记技术、细胞分选技术、单细胞 显微注射、荧光免疫、电泳技术、杂交瘤 技术、DNA转染、细胞转化、分子杂交等 促进细胞培养技术发展。
必然发生变化 。
培养细胞最多见的表现是： 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不 显、出现类似“返祖现象”； 细胞趋向单一化，或获得不死性，或变成恶性 细胞群。
41
可能的机制：
体内细胞高度分化，细胞间有高度的相互依存性、 个体细胞相对失去独立性。从受精卵形成开始，细胞
有增殖和分化两个过程 。增殖使细胞数量增多，分
46
有分化特性的细胞系和细胞株
组织来源
脾 Morris肝癌 髓性白血病 垂体瘤 黑色素瘤 髓性白血病 胶质瘤
细胞系
Friend HTC K562 GH2,GH3 B16 HL60 CCM
增殖性
永生 永生 永生 永生 永生 永生 永生 永生
物种
小鼠 大鼠 人 大鼠 小鼠 人 人 大鼠
分化特性
合成血红蛋白 酪氨酸转移酶诱导 合成血红蛋白 产生生长激素 产生色素 合成球蛋白 胶质纤维酸性蛋白 生长轴突 47