黑木耳多糖的提取分离及体外抗凝血作用研究_王辰龙
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1 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑木耳 安 徽 省 金 寨 县 大 别 山 生 态 农 产 品 公 司； 纤维素酶（ 100000U / g） 、果胶酶（ 20000U / g） 国 药集团化学试剂有限公司； 95% 乙醇、浓硫酸、苯酚、 葡萄糖、氢氧化钠、氯仿、正丁醇、浓氨水、双氧水、柠 檬酸钠等 均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 黑木耳多糖提取工艺流程 原料→干燥（ 60℃ 、 24h） →粉碎→过筛（ 60 目） →提取→过滤→上清液→醇沉多 糖→除蛋白、脱色→静置→离心→上清液→冷冻干燥→多糖 粗品 1.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制［8］ 准确称取干燥的 葡萄糖 0.01g，溶解后定容到 100mL 容量瓶中，即为 葡萄 糖 标 准 溶 液。 分 别 吸 取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0、1.2、1.4、1.6mL 的葡萄 糖 标 准 溶 液 于 试 管 中，补 水至 2mL。分别加入质量分数 6% 的苯酚溶液 1mL， 再加入浓硫酸 5mL，摇匀，室温下避光静置 20min 后 于 490nm 下测定吸光度，相同条件下以 2mL 水做空 白，以多糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准 曲线。 1.2.3 黑木耳多糖的提取方法 黑木耳多糖的提取 分别采用热水提 取 法［9］ 、碱 液 提 取 法［10］ 、超 声 波 提 取 法［11］ 、超声波协同 复 合 酶 提 取 法［12 －17］ 。 其 中，超 声 波 协同酶法的操作方法： 黑木耳干粉按 1 ∶ 50 （ w / v） 加 水，加入适当磷酸二氢钾－ 磷酸氢二纳缓冲溶液调节 pH 到 5.0，待温度升至 45℃ ，以 500U / g 加入果胶酶， 在 150W 超 声 波 功 率 下 酶 解 60min 后 迅 速 升 温 至 90℃ 钝化酶活 10min； 再加入适当磷酸二氢钾－ 磷酸 氢二纳缓冲溶液调节 pH 到 7.5，调节温度到 50℃ ，再 以 700U / g 加入纤维素酶，在 100W 超声波功率下作 用 60min 后迅速升温至 90℃ 钝化酶活 10min，过滤得 清液，离心 取 上 清 液，减 压 浓 缩 至 原 体 积 三 分 之 一 时，加入三倍体积的 95% 乙醇沉淀多糖，静置过夜， 洗涤。将多 糖 沉 淀 复 溶，反 复 脱 蛋 白、离 心，最 后 冷 冻干燥。 1.2.4 黑木耳多糖的纯化［18－19］ 1.2.4.1 脱蛋白 采用 Sevage 法［20］，按 照 黑 木 耳 多 糖水溶液 1 /4 体积加入氯仿 / 正丁醇 （ 5 ∶ 1 ） 试剂［12］， 剧烈振荡 30min，离心，倾出上清液，除去中间变性蛋 白及下层 氯 仿，重 复 操 作 直 至 中 间 层 无 变 性 蛋 白。 再以 4000r / min 离心 10min，取上清液冷冻干燥。 1.2.4.2 脱色 采用 H2 O2 法［21］，将多糖水溶液用氨 水调 pH 至 8.0，40℃ 滴加 5% H2 O2 ，保温 （ 40℃ ） 3h， 以透析分子量 8000～14000 的 DM36 透析袋于室温下 透析 4h，得黑木耳多糖。 1.2.4.3 DEAE － 纤 维 素 柱 层 析［13，21］ DEAE － Cellulose52（ Cl － ） 经湿法装柱，用 pH7.5 Tris－ HCl 缓 冲液平衡后，将脱蛋白、脱色后的多糖配成 1% 的溶 液，上样 5mL，经 DEAE － 纤 维 素 柱 层 析，洗 脱 液 为
（ 1.College of Tea ＆ Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China； 2.Insittute of Agro－products Processing，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China）
T6－ 新世纪紫外可见光分光光度计 北京普析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司； SB5200D 超 声 波 清 洗 仪 宁波 新 芝 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司； 电 子 天 平 梅特勒－ 托利多仪器（ 上海） 有限公司； DK－ S24 电热恒温 水 浴 锅 上 海 精 宏 实 验 设 备 有 限 公 司； ＲE－52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂； MPG－3 型 CAL200 凝聚仪 上海斯隆医电设备有限公司； DL－5－ B 高速离心机 上海安亭科学仪器厂； DHG－ 9423A 型电热恒温鼓风干燥箱 金坛市荣华仪器制 造有限公司。
收稿日期： 2012－10－30 * 通讯联系人 作者简介： 王辰龙（ 1987－ ） ，男，在读研究生，主要从事食品科学研究。 基金项目： 安徽农业大学大学生创新基金（ 09155） 。
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进行 纯 化、分 子 量 大 小 组 分 分 离、多 糖 修 饰 等，均 在 一定条件下表现出了抗凝血活性。本实验以大别山 野生黑木耳 为 原 料，通 过 正 交 实 验 优 化 黑 木 耳 多 糖 提取工艺，经纯化后研究其抗凝血作用的最适条件。 已有文献报道的多糖类物质的抗凝血作用都是在实 验室条件下的研究，本实验近似模拟生物体温度、血 浆 pH 条件，对黑木耳多糖的真实抗凝血效应进行研 究，为 充 分 利 用 黑 木 耳 资 源 以 及 在 生 物、医 药、食 品 方面的应用提供理论依据。
treatment on the crude polysaccharide such as deproteinization，decoloring and DEAE － cellulose column
chromatography，then the concentration，temperature and pH of the obtained purified polysaccharide were
selected as the independent variable and the prothrombin time（ PT） was selected as the indicator of anticoagulant
experiment ｉｎ ｖｉｔｒｏ both in the single factor test and orthogonal test L9 （ 33 ） .The results showed that the method of ultrasonic with compound enzyme presented the highest extraction ration，which the obtained rate was 19.14%.The
Study on extraction，isolation and ｉｎ ｖｉｔｒｏ anitcoagulation of polysaccharides from Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ
WANG Chen－ long1 ，ZHANG Zi－ qi1 ，WANG Man1 ，DING Zhi－ en1，* ，YAN Xiao－ ming2，*
Key words： Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ； polysaccharide； extraction； isolation； anticoagulation
中图分类号： TS201.1
文献标识码： B
文 章 编 号： 1002－0306（ 2013） 09－0238－04
黑木耳又称云耳、黑菜，是一种质优的胶质食用 菌和药用菌。我国黑木耳资源丰富，年产量 5000t 左 右，占世界总产量的 90% 以上，为开发应用黑木耳提 供了有利 条 件。 黑 木 耳 多 糖 具 有 预 防 冠 心 病、高 血 压、高血 脂、抗 血 栓、抗 衰 老、抗 癌 防 癌、调 节 免 疫 等 作用［1－3］。目前应 用 于 临 床 治 疗 的 抗 凝 血 药 物 主 要 是肝素和香豆素类药物，有诱发血小板症等副作用。 开发对血栓性疾病具有预防作用的新型药物或功能 性食品具 有 重 要 的 意 义。 因 而，探 索 黑 木 耳 多 糖 对 人体血液系统的影响具有重要的意义［4］。目前报道 具有抗凝血作用的多糖类物质有茶叶多糖［5］、桑叶多 糖［6］、玉米芯水溶性多糖［7］ 等，并对不同来源的多糖
Abstract： Different methods were used to extract the polysaccharides from Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ such as hot water
extraction，alkali extraction，ultrasonic extraction and ultrasonic with compound enzyme.Through several purification
purity was 83.23% after being purified.Under the condition of concentration was 10% ，temperature was 35℃，pH7.4
Hale Waihona Puke of the polysaccharides from Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ，the prothrombin time would reach 41.8s.
黑木耳多糖的提取分离 及体外抗凝血作用研究
王辰龙1 ，张子奇1 ，王 曼1 ，丁之恩1，* ，闫晓明2，* （ 1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036； 2.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽合肥 230031）
摘 要： 采用热水提取法、碱提取法、超声波提取法、超声波协同复合酶提取法的不同方法提取黑木耳多糖，粗多糖提 取液经脱蛋白、脱色、DEAE－纤维素柱层析进行纯化处理，分别选取多糖浓度、温度和 pH 为自变量，以凝血酶原时间 （ PT） 为考察指标进行体外抗凝血实验的单因素实验和正交实验 L9 （ 33 ） 。结果表明，超声波协同复合酶法提取率最 高，粗多糖得率可达到 19.14% ； 纯化后的纯度可达到 83.23% ； 黑木耳多糖在浓度为 10% 、温度为 35℃ 、pH7.4 条件下， 凝血酶原时间（ PT） 可达 41.8s。 关键词： 黑木耳，多糖，提取，分离，抗凝血
Tris－ HCl + 0.2mol / L NaCl，流速为 0.5mL / min。用自 动分部收集器收集洗脱液，每管收集 5mL，将样品收 集液稀释 10 倍后用苯酚－ 硫酸法显色，在 490nm 下 测定吸光度，计算多糖含量。以试管数目为横坐标， 吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线图。收集主峰部分溶 液，真 空 浓 缩，用 蒸 馏 水 透 析，收 集 透 析 袋 内 的 多 糖 溶液，真空浓缩，冷冻干燥，备用。 1.2.5 黑木耳多糖抗凝血作用单因素实验［22］ 本实 验选择 PT（ 凝血酶原时间） 为检测指标［23］，分别就多 糖浓度、作用温度、pH 对动物血浆体外抗凝时间的 影响进行研究。动物血浆的制备： 选择雄性成年健 康家兔，静脉取血，用 0.13mol / L 柠檬酸钠抗凝（ 体积 比 3∶1） ，3000r / min 离心 10min，取上清血浆备用。 1.2.5.1 黑木耳多糖浓度对抗凝血作用的影响 将 待测血浆分成 5 组，每组 0.50mL，分别加入 2% 、4% 、 6% 、8% 、10% 的黑木耳多糖 0.50mL，用磷酸盐缓冲 液 调 节 到 pH7.4。 对 照 组 加 入 生 理 盐 水 0.50mL。 35℃ 温育 2min 后，加入兔脑促凝血酶原 （ 按试剂说 明书使用） ，温育 2min，再加入 20mmol / L CaCl2 0.1mL 混合均匀，用凝聚仪记录凝血酶原时间。 1.2.5.2 温度对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 将 待测血浆分成 5 组，每组 0.50mL，加入 10% 的黑木耳 多糖溶液 0.50mL，用磷酸盐缓冲液调节到 pH7.4，对 照组加入生理盐水 0.50mL。35℃ 温育 2min 后，加入 兔脑促凝血酶原（ 按试剂说明书使用） ，温育 2min，再 加入 20mmol / L CaCl20.1mL 混合均匀，分别使待测样 品保持在 20、25、30、35、40℃ ，用凝聚仪记录凝血酶 原时间。 1.2.5.3 pH 对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 将待 测血浆分成 5 组，每组 0.50mL，加入 10% 的黑木耳多 糖溶液 0.50mL，用磷酸盐缓冲液分别调节样品 pH 到 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5，对 照 组 加 入 生 理 盐 水 0.50mL。 35℃ 温育 2min 后，加入兔脑促凝血酶原 （ 按试剂说 明书使用） ，温育 2min，再加入 20mmol / L CaCl20.1mL 混合均匀，用凝聚仪记录凝血酶原时间。 1.2.6 黑木耳多糖抗凝血作用正交实验 在单因素 实验的基础上，以凝血时间为考察指标，设计三因素 三水平 L9 （ 33 ） 的正交实验，确定多因素综合作用对 黑木耳多糖抗凝血作用的影响。
1.1 材料与仪器
黑木耳 安 徽 省 金 寨 县 大 别 山 生 态 农 产 品 公 司； 纤维素酶（ 100000U / g） 、果胶酶（ 20000U / g） 国 药集团化学试剂有限公司； 95% 乙醇、浓硫酸、苯酚、 葡萄糖、氢氧化钠、氯仿、正丁醇、浓氨水、双氧水、柠 檬酸钠等 均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 黑木耳多糖提取工艺流程 原料→干燥（ 60℃ 、 24h） →粉碎→过筛（ 60 目） →提取→过滤→上清液→醇沉多 糖→除蛋白、脱色→静置→离心→上清液→冷冻干燥→多糖 粗品 1.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制［8］ 准确称取干燥的 葡萄糖 0.01g，溶解后定容到 100mL 容量瓶中，即为 葡萄 糖 标 准 溶 液。 分 别 吸 取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0、1.2、1.4、1.6mL 的葡萄 糖 标 准 溶 液 于 试 管 中，补 水至 2mL。分别加入质量分数 6% 的苯酚溶液 1mL， 再加入浓硫酸 5mL，摇匀，室温下避光静置 20min 后 于 490nm 下测定吸光度，相同条件下以 2mL 水做空 白，以多糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准 曲线。 1.2.3 黑木耳多糖的提取方法 黑木耳多糖的提取 分别采用热水提 取 法［9］ 、碱 液 提 取 法［10］ 、超 声 波 提 取 法［11］ 、超声波协同 复 合 酶 提 取 法［12 －17］ 。 其 中，超 声 波 协同酶法的操作方法： 黑木耳干粉按 1 ∶ 50 （ w / v） 加 水，加入适当磷酸二氢钾－ 磷酸氢二纳缓冲溶液调节 pH 到 5.0，待温度升至 45℃ ，以 500U / g 加入果胶酶， 在 150W 超 声 波 功 率 下 酶 解 60min 后 迅 速 升 温 至 90℃ 钝化酶活 10min； 再加入适当磷酸二氢钾－ 磷酸 氢二纳缓冲溶液调节 pH 到 7.5，调节温度到 50℃ ，再 以 700U / g 加入纤维素酶，在 100W 超声波功率下作 用 60min 后迅速升温至 90℃ 钝化酶活 10min，过滤得 清液，离心 取 上 清 液，减 压 浓 缩 至 原 体 积 三 分 之 一 时，加入三倍体积的 95% 乙醇沉淀多糖，静置过夜， 洗涤。将多 糖 沉 淀 复 溶，反 复 脱 蛋 白、离 心，最 后 冷 冻干燥。 1.2.4 黑木耳多糖的纯化［18－19］ 1.2.4.1 脱蛋白 采用 Sevage 法［20］，按 照 黑 木 耳 多 糖水溶液 1 /4 体积加入氯仿 / 正丁醇 （ 5 ∶ 1 ） 试剂［12］， 剧烈振荡 30min，离心，倾出上清液，除去中间变性蛋 白及下层 氯 仿，重 复 操 作 直 至 中 间 层 无 变 性 蛋 白。 再以 4000r / min 离心 10min，取上清液冷冻干燥。 1.2.4.2 脱色 采用 H2 O2 法［21］，将多糖水溶液用氨 水调 pH 至 8.0，40℃ 滴加 5% H2 O2 ，保温 （ 40℃ ） 3h， 以透析分子量 8000～14000 的 DM36 透析袋于室温下 透析 4h，得黑木耳多糖。 1.2.4.3 DEAE － 纤 维 素 柱 层 析［13，21］ DEAE － Cellulose52（ Cl － ） 经湿法装柱，用 pH7.5 Tris－ HCl 缓 冲液平衡后，将脱蛋白、脱色后的多糖配成 1% 的溶 液，上样 5mL，经 DEAE － 纤 维 素 柱 层 析，洗 脱 液 为
（ 1.College of Tea ＆ Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China； 2.Insittute of Agro－products Processing，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China）
T6－ 新世纪紫外可见光分光光度计 北京普析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司； SB5200D 超 声 波 清 洗 仪 宁波 新 芝 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司； 电 子 天 平 梅特勒－ 托利多仪器（ 上海） 有限公司； DK－ S24 电热恒温 水 浴 锅 上 海 精 宏 实 验 设 备 有 限 公 司； ＲE－52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂； MPG－3 型 CAL200 凝聚仪 上海斯隆医电设备有限公司； DL－5－ B 高速离心机 上海安亭科学仪器厂； DHG－ 9423A 型电热恒温鼓风干燥箱 金坛市荣华仪器制 造有限公司。
收稿日期： 2012－10－30 * 通讯联系人 作者简介： 王辰龙（ 1987－ ） ，男，在读研究生，主要从事食品科学研究。 基金项目： 安徽农业大学大学生创新基金（ 09155） 。
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进行 纯 化、分 子 量 大 小 组 分 分 离、多 糖 修 饰 等，均 在 一定条件下表现出了抗凝血活性。本实验以大别山 野生黑木耳 为 原 料，通 过 正 交 实 验 优 化 黑 木 耳 多 糖 提取工艺，经纯化后研究其抗凝血作用的最适条件。 已有文献报道的多糖类物质的抗凝血作用都是在实 验室条件下的研究，本实验近似模拟生物体温度、血 浆 pH 条件，对黑木耳多糖的真实抗凝血效应进行研 究，为 充 分 利 用 黑 木 耳 资 源 以 及 在 生 物、医 药、食 品 方面的应用提供理论依据。
treatment on the crude polysaccharide such as deproteinization，decoloring and DEAE － cellulose column
chromatography，then the concentration，temperature and pH of the obtained purified polysaccharide were
selected as the independent variable and the prothrombin time（ PT） was selected as the indicator of anticoagulant
experiment ｉｎ ｖｉｔｒｏ both in the single factor test and orthogonal test L9 （ 33 ） .The results showed that the method of ultrasonic with compound enzyme presented the highest extraction ration，which the obtained rate was 19.14%.The
Study on extraction，isolation and ｉｎ ｖｉｔｒｏ anitcoagulation of polysaccharides from Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ
WANG Chen－ long1 ，ZHANG Zi－ qi1 ，WANG Man1 ，DING Zhi－ en1，* ，YAN Xiao－ ming2，*
Key words： Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ； polysaccharide； extraction； isolation； anticoagulation
中图分类号： TS201.1
文献标识码： B
文 章 编 号： 1002－0306（ 2013） 09－0238－04
黑木耳又称云耳、黑菜，是一种质优的胶质食用 菌和药用菌。我国黑木耳资源丰富，年产量 5000t 左 右，占世界总产量的 90% 以上，为开发应用黑木耳提 供了有利 条 件。 黑 木 耳 多 糖 具 有 预 防 冠 心 病、高 血 压、高血 脂、抗 血 栓、抗 衰 老、抗 癌 防 癌、调 节 免 疫 等 作用［1－3］。目前应 用 于 临 床 治 疗 的 抗 凝 血 药 物 主 要 是肝素和香豆素类药物，有诱发血小板症等副作用。 开发对血栓性疾病具有预防作用的新型药物或功能 性食品具 有 重 要 的 意 义。 因 而，探 索 黑 木 耳 多 糖 对 人体血液系统的影响具有重要的意义［4］。目前报道 具有抗凝血作用的多糖类物质有茶叶多糖［5］、桑叶多 糖［6］、玉米芯水溶性多糖［7］ 等，并对不同来源的多糖
Abstract： Different methods were used to extract the polysaccharides from Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ such as hot water
extraction，alkali extraction，ultrasonic extraction and ultrasonic with compound enzyme.Through several purification
purity was 83.23% after being purified.Under the condition of concentration was 10% ，temperature was 35℃，pH7.4
Hale Waihona Puke of the polysaccharides from Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａｒ，the prothrombin time would reach 41.8s.
黑木耳多糖的提取分离 及体外抗凝血作用研究
王辰龙1 ，张子奇1 ，王 曼1 ，丁之恩1，* ，闫晓明2，* （ 1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036； 2.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽合肥 230031）
摘 要： 采用热水提取法、碱提取法、超声波提取法、超声波协同复合酶提取法的不同方法提取黑木耳多糖，粗多糖提 取液经脱蛋白、脱色、DEAE－纤维素柱层析进行纯化处理，分别选取多糖浓度、温度和 pH 为自变量，以凝血酶原时间 （ PT） 为考察指标进行体外抗凝血实验的单因素实验和正交实验 L9 （ 33 ） 。结果表明，超声波协同复合酶法提取率最 高，粗多糖得率可达到 19.14% ； 纯化后的纯度可达到 83.23% ； 黑木耳多糖在浓度为 10% 、温度为 35℃ 、pH7.4 条件下， 凝血酶原时间（ PT） 可达 41.8s。 关键词： 黑木耳，多糖，提取，分离，抗凝血
Tris－ HCl + 0.2mol / L NaCl，流速为 0.5mL / min。用自 动分部收集器收集洗脱液，每管收集 5mL，将样品收 集液稀释 10 倍后用苯酚－ 硫酸法显色，在 490nm 下 测定吸光度，计算多糖含量。以试管数目为横坐标， 吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线图。收集主峰部分溶 液，真 空 浓 缩，用 蒸 馏 水 透 析，收 集 透 析 袋 内 的 多 糖 溶液，真空浓缩，冷冻干燥，备用。 1.2.5 黑木耳多糖抗凝血作用单因素实验［22］ 本实 验选择 PT（ 凝血酶原时间） 为检测指标［23］，分别就多 糖浓度、作用温度、pH 对动物血浆体外抗凝时间的 影响进行研究。动物血浆的制备： 选择雄性成年健 康家兔，静脉取血，用 0.13mol / L 柠檬酸钠抗凝（ 体积 比 3∶1） ，3000r / min 离心 10min，取上清血浆备用。 1.2.5.1 黑木耳多糖浓度对抗凝血作用的影响 将 待测血浆分成 5 组，每组 0.50mL，分别加入 2% 、4% 、 6% 、8% 、10% 的黑木耳多糖 0.50mL，用磷酸盐缓冲 液 调 节 到 pH7.4。 对 照 组 加 入 生 理 盐 水 0.50mL。 35℃ 温育 2min 后，加入兔脑促凝血酶原 （ 按试剂说 明书使用） ，温育 2min，再加入 20mmol / L CaCl2 0.1mL 混合均匀，用凝聚仪记录凝血酶原时间。 1.2.5.2 温度对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 将 待测血浆分成 5 组，每组 0.50mL，加入 10% 的黑木耳 多糖溶液 0.50mL，用磷酸盐缓冲液调节到 pH7.4，对 照组加入生理盐水 0.50mL。35℃ 温育 2min 后，加入 兔脑促凝血酶原（ 按试剂说明书使用） ，温育 2min，再 加入 20mmol / L CaCl20.1mL 混合均匀，分别使待测样 品保持在 20、25、30、35、40℃ ，用凝聚仪记录凝血酶 原时间。 1.2.5.3 pH 对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 将待 测血浆分成 5 组，每组 0.50mL，加入 10% 的黑木耳多 糖溶液 0.50mL，用磷酸盐缓冲液分别调节样品 pH 到 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5，对 照 组 加 入 生 理 盐 水 0.50mL。 35℃ 温育 2min 后，加入兔脑促凝血酶原 （ 按试剂说 明书使用） ，温育 2min，再加入 20mmol / L CaCl20.1mL 混合均匀，用凝聚仪记录凝血酶原时间。 1.2.6 黑木耳多糖抗凝血作用正交实验 在单因素 实验的基础上，以凝血时间为考察指标，设计三因素 三水平 L9 （ 33 ） 的正交实验，确定多因素综合作用对 黑木耳多糖抗凝血作用的影响。