抗氧化性测定方法

3. 2. 3 冬枣多酚含量的测定
（1）福林-肖卡试剂（Folin-ciocalteu）的配制
称取100克钨酸钠和25克钼酸钠，将两者溶于700mL水中，倒入2L的圆底烧瓶中，再加入50mL85%的磷酸和100mL浓盐酸，放入几粒玻璃珠，给烧瓶连上回流冷凝器，用文火回流10h（可不连续）;回
流后用50mL蒸馏水冲洗冷凝管上的附着物，然后取下，加150克硫酸锂和几滴溴水（边加边摇直至溶
液变黄），加热煮沸15min，（注：最后的颜色应是黄色，不带丝毫的蓝色绿色，发绿即不得使用）。

冷却后转移到1L的容量瓶中，用水定容至刻度，过滤贮存于棕色瓶中备用
（2）多酚标准曲线的绘制
取洁净干燥试管7支，分别标号0-6，分别加入预先配制的0.4mg/mL的没食子酸0，0.05，0.1，
0.15，0.2，0.25，0.35mL，再分别加入双蒸水，2，1.95，.1.9，1.85，1.8，1.75，1.7，1.65mL。

将储
存备用的福林肖卡试剂稀释3倍，于7支试管中分别加入1mL，将7支试管振荡摇匀，静置3-4min，再于7支
试管中分别加入10%的碳酸钠各1mL，放入25℃恒温水浴中2h。

进行全波长扫描，在765 nm处有最大吸收波
长，在此波长下测定不同浓度标准溶液的吸光值，绘制多酚浓度与吸光度的标准曲线。

（3）测定
将上述八种原液稀释相应倍数之后，各取0.1mL于试管中，在各加入1.99mL双蒸水，其余操作同标准曲
线绘制，于765nm波长处测定吸光值。

2.3.2多酚含量测定
2.3.2.1多酚标准曲线的制作[5]
准确称取没食子酸标准品200mg，加少量70%乙醇将样品溶化，用70%乙醇定容至100mL，摇匀，静置。

再用移液器吸取20mL，用70%乙醇定容至100mL，摇匀，配成浓度为400µg/mL 的没食子酸标准溶液，待用。

准确吸取浓度为的没食子酸标准溶液0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.35ml
于试管中。

分别加入蒸馏水2.0,1.95,1.9,1.85,1.8,1.75,1.65ml，再各加入福林试剂1ml,充分振荡后静置3-4min:，分别加入10%碳酸钠1ml于25℃，摇匀置于恒温水浴中反应2h,同时做试剂空白，于765nm下测定吸光度，以含量对吸光度进行直线回归，计算回归方程。

2.3.2.2试样多酚含量的测定
将提取液离心，取上清液，按标准曲线绘制的测定方法，依次加入试剂，以试剂空白作参比，用1cm比色皿在765nm处测定吸光度，计算多酚含量。

2.2.
3.1总还原能力测定(铁氰化钾还原法)[19][20]
还原力法的原理为：K3Fe(CN)6+ 样品→ K4Fe(CN)6+ 样品氧化物
K4Fe(CN)6 + Fe3+ → Fe4[Fe(CN)6]3
在波长7 0 0 n m 条件下测定吸光度A ，A 越大，则样品的还原力越大。

在2.5ml pH=6.6 磷酸缓冲溶液中加分别入芦丁标准溶液（0.6mg/ml）：0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3ml，双蒸水1、0.95、 0.9、0.85、0.8、0.75、0.7ml，再加入1% 铁氰化钾1ml，混合物在50℃恒温条件下，加热20min。

急速冷却，加2.5ml 10% 三氯乙酸，3500转/分离心分离10min。

取上层清液2、5ml、双蒸水2、5ml ，再加0、5ml 0.1%FeCl3，混合均匀，静置10min 后在波长700nm 下测吸光度A 值,绘制标准曲线。

样品测定：分别取720mg/ml的提取液、维生素C、TBHQ、BHT溶液0.5ml代替芦丁标准溶液，其他操作同标准溶液的绘制，测定吸光度。

结果如图12、13所示。

2.2.
3.2清除DPPH自由基的能力测定[20]
DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3 个苯环，1 个氮原子上有1 个孤
对电子，呈紫色，在517nm 有强吸收。

有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜
色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量
关系的,因此可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。

取0.04mg/ml的DPPH-乙醇溶液1.5ml，加入适量提取液用95%乙醇补足3ml。

静置30min，在
517nm处测定吸光度。

同时测定维生素C、合成抗氧化剂TBHQ 对DPPH 自由基的清除率，作为对比。

清除率 = [1-(A1- A2)/A0]×100
其中：A1为加提取液后DPPH 溶液的吸光度；
A2为提取液的吸光度；
A0为未加提取液时DPPH 溶液的吸光度。

结果如图14所示。

2.2.
3.3 清除羟自由基作用的测定[20][21]
通过Fenton反应产生·OH，水杨酸捕获·OH产生有色物质，该物质在510nm有特征吸收，通
过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物，确定·OH的清除率。

在10ml试管中加入一定浓度的待测液，然后加入0.3ml6mmol/LFeSO4，1.5ml6mmol/L水杨酸
用双蒸水补齐4.8ml摇匀，最后加入0.3ml 6mmol/LH2O2启动反应，静置10min后于510nm处测定吸
光度。

考虑到提取液本身的吸光值，做试样空白，测出扣除试样空白的吸光度，同时测定空白对照液的吸光度。

清除率（%）= (A0– A1+ A2)/ A0
其中：A0为未加提取液时溶液的吸光度。

A1为加提取液后溶液的吸光度；
A2为提取液的吸光度。

结果如图15所示。

2.2.
3.4 超氧阴离子清除率的测定
超氧阴离子自由基是生物体内和食品体系中起主要作用的自由基，因此，测定提取液对超氧阴离子的清除率具有重要意义。

待测液清除超氧阴离子能力测定采用邻苯三酚自氧化法具体操作参照文献[22]，稍作修改。

取3ml 0.05mol/L Tris-HCL 缓冲溶液(pH = 8.2) ,置于25 ℃水浴中预热20min ,分别加入同体积不同浓度的待测液溶液和0.6ml 30mmol/L的邻苯三酚溶液,混匀后于25 ℃水浴中预热5min ,加入0.5ml 1mol/LHCL 终止反应,于420nm 处测定吸光度A1 。

A0 空白对照以同体积的双蒸水代替样品,吸光度记为A。

考虑到待测液本身可能在420nm 处有吸收,用同体积的双蒸水代替邻苯三酚溶液,得A2 。

按下式计算抗氧化剂清除率。

清除率=（A0-A1+A2）/A0×100 %
式中: A0 为不加样品的对照值,
A1 为加样品后的测定值,
A2 为样品在体系中的吸光值。

测定结果见图16.
2.2.
3.5 提取物对亚硝基清除作用的测定[23]
-在酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮反应后，再与N-1苯基乙二胺盐酸盐偶合生成紫红色络NO
2
-的量。

合物，在540nm 处有最大吸收，可用比色法测定NO
2
分别吸取同浓度的黄酮提取液、维生素C溶液、合成抗氧化剂TBHQ、BHT溶液于25ml容量瓶中，加入5mg/ml的亚硝酸钠溶液0.5ml，各加入0.4%对氨基苯磺酸1ml，再加入0.2%盐酸萘乙二胺显色
剂0.5ml，摇匀加水至刻度，静置15分钟，测定吸光度。

结果如图17、18所示。

3. 2. 4 提取液抗氧化活性的测定（铁氰化钾还原法）
（1）原理
在波长700nm条件下测定吸光度A，A越大，则样品的还原力越大。

（2）以没食子酸为样品绘制标准曲线
取十支洁净试管，编号0至9，每支试管中加入2.5mLph=6.6的磷酸缓冲溶液，由0至9分别加入没食
子酸0，40，80，120，160，200，240，280，320，360mg，再分别加入10%铁氰化钾1mL。

放置于50℃水浴
中加热20min,然后急速冷却。

再分别加入10%三氯乙酸2.5mL，4000转/分离心10min。

各取上清液2.5mL，
再加2.5mL双蒸水，于700nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

（3）以芦丁为样品绘制标准曲线
取五支洁净试管，编号0至4，每支试管中加入2.5mLph=6.6的磷酸缓冲溶液，由0至4分别加入芦丁0，120，160，180，240mg，其余操作同上，绘制标准曲线。

（4）测定
将上述八种原液稀释相应倍数之后，各取0.5mL，操作同标准曲线，测定700nm吸光度。

2.3.3总抗氧化性的测定方法
2.3.3.1抗氧化性标准曲线绘制(铁氰化钾还原法) [8] [9]
以400ug/ml的没食子酸标准溶液为标准绘制抗氧化性标准曲线。

方法如下：
在2.5ml pH=6.6 磷酸缓冲溶液中加入没食子酸标准溶液0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.9ml，用双馏水补齐到1ml,加入1ml 1% 铁氰化钾，混合物在50℃恒温条件下，加热20min。

急
速冷却，加2.5ml 10% 三氯乙酸，3500转离心分离10min。

取上层清液2.5ml，加2.5ml双馏水，
再加0.5ml 0.1%FeCl3，混合均匀，静置10min 后在波长700nm 下测吸光度A 值。

A 越大，则样
品的还原力越强。

2.3.3.2试样抗氧化性的测定
将提取液离心，取上清液，按标准曲线绘制的测定方法，依次加入试剂，以试剂空白作参比，用1cm比色皿在700nm处测定吸光度,比较其抗氧化活性。