植物组织培养中灭菌和无菌操作的几个问题

植物组织培养中灭菌和无菌操作的几个问题
朱广廉北京大学生命科学学院, 北京。。
在植物组织培养工作中, 对培养基和器
皿的彻底灭菌及正确的无菌操作是防止染
菌、保证组培材料正常生长及分化的关键, 是
组培工作中最基本, 也是最重要的技术。从事
与组培工作有关的科学工作者, 在实践中应
能根据工作的性质、条件及要求, 灵活、巧妙
地应用有关的原理, 熟练、敏捷、正确地进行
操作。但是, 在教学和科研中, 总可见到一些
不正确的操作, 反映出对有关概念和原理认
识上的模糊。下面谈谈我曾遇到的几个问题
及看法, 供同行们借鉴。
灭菌、消毒和除菌
所谓灭菌系指采用物理或化学的方法杀
死物体表面及内部的全部微生物。它有别于
消毒。消毒一说来源于医学, 是一种卫生措
施, 通常指只杀死有害的病原微生物。除菌是
应用机械或其他物理的方法除去液体或气体
中的微生物, 达到无菌净化之目的。可见灭菌
及除菌后的物体或介质是无菌的, 而消毒后
的物体可能仍含有许多微生物。在教学和工
作中常常听到把灭菌称为消毒, 将除菌说成
灭菌, 或将灭菌、消毒和除菌三个不同的概念
混为一谈。这是应该予以澄清的。
高温灭菌
高温灭菌是指用热能杀死微生物。其原
理是高温使原生质中的蛋白质变性、使酶失
活, 致使微生物死亡。高温灭菌是植物组培中
最常用的灭菌方法, 主要的有高温蒸气灭菌、
干热灭菌和灼烧灭菌。
高温蒸气灭菌蒸气灭菌属湿热灭菌。
由于湿热灭菌有潜热存在, 被灭菌物体的温
度比蒸气的低, 蒸气在其表面凝结成水, 放出
潜热, 可迅速提高被灭菌物体的温度。又由于
水和水蒸气比空气的热容量大、导热快、穿透
力强, 所以, 与干热灭菌比, 需要的温度低、时
间短, 组培中常用于培养基和器皿的灭菌。
水蒸气的温度随其所受压力的增加而升
高, 因而灭菌用的高温蒸气都是通过加压获
得的。手提式高压灭菌锅是组培工作中最常
用的高压灭菌装置。操作中常见的错误有
排气不彻底。在升压前应将锅内冷空气排
净, 因空气是热不良导体, 若不排净, 冷空气
就会聚集并滞留在灭菌锅中消毒筒的中下
部, 围绕在待灭菌物周围。在这种情况下, 假
若锅内空气仅排除一半, 当压力表指针达到
时, 锅内实际温度仅能达到℃ ,
比要求的
’
低之多, 将导致灭菌不彻
底, 可能造成大面积染菌。排气软管没按
要求插入灭菌筒内的下部, 或排气软管断裂、
缺失。灭菌锅内的冷空气是通过排气软管排
出的, 匕述情况将造成灭菌筒外的蒸气直接
经排气阀排出锅外, 灭菌筒内的空气排放受
阻。消毒

筒内物品堆积太紧、太满, 阻碍蒸
气的流通和热交换, 使容器内升温减慢, 造成
物体内部杀菌不完全。升温过快。灭菌的
时间是以达到要求温度后的持续时间计算
的, 但温度的升降过程同样起到杀菌的作用,
升降温过快会通过影响总的积温而影响灭菌
效果。另外, 升温过快, 特别是使用外源蒸气
的情况下, 会造成被灭菌物体内部升温滞后
于压力表指示温度。灭菌的物体休积容
量过大。组培中, 高温蒸气灭菌通常要在
、即蒸气压力为, , 或三· 磅时,
或下保温。这一规定仅适
用于试管、三角瓶中小容量的培养基小于
。若体积过大, 特别是固体培养基, 会
造成灭菌不彻底, 应适当延长灭菌时间。
任意延长灭菌时间。规定的灭菌温度和时间
收稿洲
一
韶

是经过科学试验制定的, 只要按照正确的灭
菌程序操作是能达到灭菌目的的。但在实践
中常有人为了“ 保证彻底灭菌”而任意延长灭
菌时间。这样操作忽视了杀菌过程中温度对
培养基成分的破坏作用, 是得不偿失的。
温度不稳定。灭菌过程中温度压力忽高忽
低, 特别是手提式电能灭菌锅, 它没有控温装
置, 难于控温。操作者可配置调压变压器, 通
过调节电压控温。此外, 还常遇到灭菌锅内加
水太少应加一, 容器内装的溶液量过
多应小于, 安全阀失灵等问题。
千热灭菌指在烤箱内用干热空气灭
菌, 常用于玻璃器皿和金属用具的灭菌。由于
空气的导热性和穿透力小于饱和蒸气, 加上
菌体在受热脱水情况下又较耐热, 因而, 通常
要在一‘
下连续灭菌才能达
到灭菌目的。曾遇见的错误操作有将灭菌的
物品如培养皿堆挥放置, 且堆得过满、过
挤, 阻碍空气流通和热量的传递、交换升温
时不打开箱顶通风孔, 影响箱内冷空气及水
汽的排除高温℃以上下开箱取物, 热蒸
气喷出造成烧伤及突然降温, 使玻璃器皿破
裂温度过高大干造成包装纸、棉塞
焦化, 失去防菌或过滤作用将不耐热的枪
头、离心管、试管帽、滤器等塑料制品放入烤
箱内灭菌, 而致其熔化。
灼烧灭菌即直接利用火焰将微生物
灼烧致死。其特点是简便、迅速、彻底。主要
用于接种工具及器皿的灭菌。如对接种环、镊
子、剪刀、玻棒、瓶口及封口用的铝箔的灭菌。
常见的错误操作有接种工具的灭菌范围不
够, 如对接种镊子的灭菌, 长度应大于插入容
器中的长度, 且包括镊子的内外两侧接种工
具没有降至常温即用于接种对玻璃器皿灼
烧过度, 使棉塞、封口膜焦化或熔化。
过滤除菌
除菌是指用过滤、离心分离、静电吸附等
机械或物理的方法除去气、液体中的微生物。
组培中常用的洁净工作台

就是利用多孔滤板
的吸附和过滤作用净化空气的。对液体培养
基常用滤膜或玻璃滤器除菌, 主要用于对热
不稳定、易失活或分解的物质, 如酶液的除
菌。最常遇到的问题是洁净工作台的环境不
“ 洁净” , 不经常拖擦地面, 灰尘太多。有的甚
至将工作台放在走廊中, 常落上一层尘土, 这
不但会极大地缩短洁净工作台的使用寿命,
也会增加染菌的机率。有条件者最好放在一
个密闭、洁净的小室内。对培养基过滤灭菌,
应精心选择适当孔径的滤膜或滤板。
乙醇灭菌
乙醇杀菌的原理是它具有脱水作用。脱
水作用导致蛋白质变性, 致使微生物死亡。乙
醇的脱水作用在一定浓度范围内随浓度增加
而加强。但是, 其脱水作用能致使菌体表面形
成一层蛋白质膜, 降低乙醇进入细胞的穿透
力。乙醇既具有较强的杀菌力, 又具有较
强的穿透力, 杀菌作用最强。这里应着重指出
的是, 的乙醇浓度指的是重量百分比浓
度, 而很多人却误认为是容量百分比浓度其
容量百分比浓度约为。在实际应用时
还应根据被灭菌物体表面的含水量灵活掌
握, 表面干燥的物体可用乙醇表面湿
润的植物材料可用乙醇杀菌, 这样可获
得更好的效果。若在乙醇中加入或
, 杀菌效果会更好。
蒸气灭菌对培养墓的影响
在高温蒸气灭菌过程中, 培养基内会发
生一些化学反应, 培养基的成分会伴随着发
生一些变化。
改变培养基的营养成分。淀粉、糖、蛋
白质等营养成分在高温下, 特别是培养基
值较高或较低时, 会发生水解若有磷酸盐存
在, 可使葡萄搪转化成酮糖还原糖的拨基与
氨基酸的氨基反应形成氨基糖葡萄糖、
乳糖和蔗糖糖液, 在下保温, 可
分别破坏达、和。总之, 高温灭
菌对培养基营养成分有明显的破坏作用。
培养基颜色变褐。其主要原因有还


原糖与氨基酸在高温下发生反应, 形
成褐色物质可溶性糖转化成深色的焦糖。
培养基的值降低。一般情况下,
经灭菌后培养基值下降, 通常可下降
。常遇到的问题是, 培养基值调节
得不准确, 若偏低, 会出现灭菌后培养基不固
化。在这种情况下绝不能调高值进行二
次灭菌后再用。因为二次灭菌的培养基营养
成分会受到严重破坏。另一个问题是, 值
下降会影响培养基成分的解离度、甚至带电
荷的性质, 影响培养物原生质膜表面带电荷
的性质及电荷量, 进而影响原生质体细胞
对营养成分的吸收及其酶的活化和活力。
产生沉淀物质。灭菌后的培养基常出
现浑浊和沉淀。主要原因是培养基中的、
、、等阳离子在高温下与磷酸盐反应
形成沉淀培养基中的蛋白质等有机大分子
受热变性、凝聚, 产生沉

淀。
此外, 灭菌还可产生对组培材料有抑制
作用的有害物质, 产生冷凝水, 改变培养基的
体积和浓度。
接种时的无菌操作
无菌操作技术直接地关系到组培材料的
染菌率。实践中曾遇到的问题有环境污染严
重, 对染菌与环境的相关性缺乏认识对洁净
工作台的灭菌只重视擦洗台面, 对操作台的
正面、顶部和左右壁不用乙醇喷雾灭菌紫外
线杀菌时间太短应为一, 流于形
式将大量待接种的培养瓶、器皿等放入洁净
工作台内, 甚至放在工作面的前部, 且不对它
们进行杀菌处理, 忘记了它们是带菌者接种
时不是将瓶口与送风的流动方向平行, 而是
将瓶口向上或迎着来风方向操作, 不理解这
样操作会增加染菌率手的消毒流于形式, 只
用乙醇擦试, 不用肥皂彻底清洗, 消毒后任意
抓摸带菌的器皿、用具错误地认为洁净工作
台内前半部的通风量大, 因而, 接种时将两臂
连同脑袋伸到洁净工作台内工作, 不理解洁
净工作台内前后部的横截面积相等, 通风量
的大小是相同的。总之, 无菌观念不强, 对染
菌的原因缺乏深入的分析和认识是产生上述
错误操作的原因。
以上分析说明, 对组培有关原理的正确
理解和规范的无菌操作不仅可降低染菌率、
减少事故发生, 更重要的是可保证组培材料
健康的生长分化。因此, 在教学中必须阐明组
培的有关原理, 对无菌操作严格要求, 才能把
学生培养成既懂原理又精于操作的严谨的组
培工作者。
植物生理学通讯例翻乙只匆戚而男‘如切翻切蒯, , 一
未来植物开花研究之管见
陈永宁中国科学院上海植物生理研究所, 上海。。。
近年来, 开花研究再度成为热点。这是由
两方面的因素决定的开花是植物生活史
上的重要质变过程, 研究其调控机理, 无论是
在理论上, 还是在应用中, 意义都是不言而喻
的。这也是多少年来, 开花研究始终具有吸引
力的原因。分子生物学技术日臻完善, 特
别是在微生物和动物方面已取得突破性进
展。人们有可能将其作为一种新的手段应用
收稿一一
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