第五章动物细胞制药
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能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml但在含HAT 选 择培养基中不能存活。通常用培养基为 DMEM，添加10%胎牛血清。用于生产单抗 杂交瘤细胞和抗体。
第五章动物细胞制药
五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库 ⒉生产用细胞库
第五章动物细胞制药
⒈原始细胞库 贮存时须有该细胞的详细挡案，包括： ①该细胞系的历史 ②该细胞系的特性 ③对各种有害因子的检查结果
腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。
杆状病毒： 用于外源基因表达。
第五章动物细胞制药
其作为载体的 优点： ①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的形 成。 ③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系， 因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能 形成有感染力病毒粒子；
第五章动物细胞制药
10%小牛血清，pH7.2, 同工酶为G6PD B型。 倍增时间为24h， 有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。
第五章动物细胞制药
BHK-21: 从5只无性别的生长1天的地鼠幼 鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为 2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、 狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞 构建。
第五章动物细胞制药
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/12/11
第五章动物细胞制药
④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生 的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；
⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为 标记物，选阳性克隆。
⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源 基因。
第五章动物细胞制药
质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增，都
含有如下基本成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
后修饰糖基化，与天然产品一致。
第五章动物细胞制药
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系
第五章动物细胞制药
二、生产用动物细胞的获得
⒈原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过粉碎消
化而获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、
第五章动物细胞制药
⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
第五章动物细胞制药
基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法
第五章动物细胞制药
磷酸钙沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷
酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形 成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面 接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。
第五章动物细胞制药
电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使
细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源 DNA沿小孔进入细胞。转化率较高， 拷贝数低。
第五章动物细胞制药
四、常用生产用动物细胞的特性
W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原，
培养基用BME（Eagle’ Basal medium）
第五章动物细胞制药
⒈贴壁细胞
生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或 培养基中提供的贴附因子才能在该表面上 生长。
两种形态：
成纤维细胞型 上皮细胞型
第五章动物细胞制药
⒉悬浮细胞
生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮 状态生长。如淋巴细胞。
⒊兼性贴壁细胞
生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细 胞，小鼠L929细胞。
第五章动物细胞制药
Vero： 从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；
培养基为199培养基，加5%胎牛血清； 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓 灰质炎、狂犬病毒。
第五章动物细胞制药
SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗 红细胞活性的BALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓 瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NLAg 亚克隆中分离获得，
被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
第五章动物细胞制药
⒈真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类：
㈠病毒载体
牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒
㈡质粒载体
第五章动物细胞制药
㈠病毒载体
牛痘病毒： 用构建多价疫苗
通过某个转化过程形成的，常由于染色体 断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而 获得无限增殖能力。转化过程可以是自发 的，和人工的，从肿瘤组织中。
第五章动物细胞制药
4.融合细胞系
(1)仙台病毒融合法 (2)聚乙二醇融合法 (3)电融合法
5.重组工程细胞系
第五章动物细胞制药
三、基因工程细胞构建和筛选
在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞 及采用基因工程构建的各种工程细胞。
用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂 犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。
第五章动物细胞制药
CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分 离的上皮样细胞。 核型： 2n=20～22。 培养基：DEME培养基 0.1mmol/L次黄嘌呤， 0.1mmol/L胸苷， 10%小牛血清， 加入脯氨酸。
第五章动物细胞制药
S期：6～8h DNA合成 G2期：2～5h DNA量加倍,
RNA合成 M期：0.5～1h 染色体分裂
第五章动物细胞制药
第五章动物细胞制药
细胞代数为细胞分裂次数 传代数表示细胞培养分种传代次数
细胞代数=传代数×分种数/2 X=(logN-logNo)÷log2 X 代数 N 培养最终细胞数 No 培养起始细胞数
第五章动物细胞制药
2020/12/11
第五章动物细胞制药
第三章 动物细胞制药
第五章动物细胞制药
第一节 概 述
细胞学说的建立 组织培养和细胞培养 细胞工程学
第五章动物细胞制药
第二节 动物细胞的形态和生理特点
一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞
第五章动物细胞制药
MRC-5： 从正常男性肺组织中获得的人二倍 体细胞系。
核型为2n=46。 属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。
有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38 快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人 的病毒敏感。用于生产疫苗。
第五章动物细胞制药
Namalwa： 从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取， 建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率， 12～14条标记染色体。单条X，无Y。培养基 为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产 α干扰素。
第五章动物细胞制药
Sf-9： 1983年从亲代IPLB—SF21AE中克 隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分 离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其 它杆状病毒高度敏感。
通常用的培养基为Grace培养基，添加 3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液, 10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。
淋巴细胞。
第五章动物细胞制药
⒉二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细 胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有 一定特征的细胞株。
第五章动物细胞制药
二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。
第五章动物细胞制药
⒊转化细胞系
倍增时间=培养经过时间÷代数
第五章动物细胞制药
⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制 现象。
⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。
原代培养 有限细胞系 无限细胞系
第五章动物细胞制药
⒋动物细胞对周围环境十分敏感.
各种理化因素：渗透压、pH、离子浓度、 剪切 力、微量元素等。
⒌动物细胞对培养基要求高
必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、 葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。
第五章动物细胞制药
二、动物细胞的化学组成和代谢
v 1.动物细胞的化学组成
v 2.动物细胞的代谢
第五章动物细胞制药
三、动物细胞的生理特点
⒈ 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12～48h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）
第五章动物细胞制药
G1期：4～6h 合成DNA聚合酶 RNA合成
第五章动物细胞制药
⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功 能与细菌不同。
动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体：合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面糖蛋白。
第五章动物细胞制药
动物细胞生产药物
缺点:培养条件高、成本贵、产量低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译
第五章动物细胞制药
五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库 ⒉生产用细胞库
第五章动物细胞制药
⒈原始细胞库 贮存时须有该细胞的详细挡案，包括： ①该细胞系的历史 ②该细胞系的特性 ③对各种有害因子的检查结果
腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。
杆状病毒： 用于外源基因表达。
第五章动物细胞制药
其作为载体的 优点： ①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的形 成。 ③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系， 因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能 形成有感染力病毒粒子；
第五章动物细胞制药
10%小牛血清，pH7.2, 同工酶为G6PD B型。 倍增时间为24h， 有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。
第五章动物细胞制药
BHK-21: 从5只无性别的生长1天的地鼠幼 鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为 2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、 狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞 构建。
第五章动物细胞制药
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/12/11
第五章动物细胞制药
④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生 的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；
⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为 标记物，选阳性克隆。
⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源 基因。
第五章动物细胞制药
质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增，都
含有如下基本成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
后修饰糖基化，与天然产品一致。
第五章动物细胞制药
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系
第五章动物细胞制药
二、生产用动物细胞的获得
⒈原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过粉碎消
化而获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、
第五章动物细胞制药
⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
第五章动物细胞制药
基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法
第五章动物细胞制药
磷酸钙沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷
酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形 成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面 接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。
第五章动物细胞制药
电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使
细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源 DNA沿小孔进入细胞。转化率较高， 拷贝数低。
第五章动物细胞制药
四、常用生产用动物细胞的特性
W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原，
培养基用BME（Eagle’ Basal medium）
第五章动物细胞制药
⒈贴壁细胞
生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或 培养基中提供的贴附因子才能在该表面上 生长。
两种形态：
成纤维细胞型 上皮细胞型
第五章动物细胞制药
⒉悬浮细胞
生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮 状态生长。如淋巴细胞。
⒊兼性贴壁细胞
生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细 胞，小鼠L929细胞。
第五章动物细胞制药
Vero： 从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；
培养基为199培养基，加5%胎牛血清； 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓 灰质炎、狂犬病毒。
第五章动物细胞制药
SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗 红细胞活性的BALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓 瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NLAg 亚克隆中分离获得，
被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
第五章动物细胞制药
⒈真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类：
㈠病毒载体
牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒
㈡质粒载体
第五章动物细胞制药
㈠病毒载体
牛痘病毒： 用构建多价疫苗
通过某个转化过程形成的，常由于染色体 断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而 获得无限增殖能力。转化过程可以是自发 的，和人工的，从肿瘤组织中。
第五章动物细胞制药
4.融合细胞系
(1)仙台病毒融合法 (2)聚乙二醇融合法 (3)电融合法
5.重组工程细胞系
第五章动物细胞制药
三、基因工程细胞构建和筛选
在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞 及采用基因工程构建的各种工程细胞。
用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂 犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。
第五章动物细胞制药
CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分 离的上皮样细胞。 核型： 2n=20～22。 培养基：DEME培养基 0.1mmol/L次黄嘌呤， 0.1mmol/L胸苷， 10%小牛血清， 加入脯氨酸。
第五章动物细胞制药
S期：6～8h DNA合成 G2期：2～5h DNA量加倍,
RNA合成 M期：0.5～1h 染色体分裂
第五章动物细胞制药
第五章动物细胞制药
细胞代数为细胞分裂次数 传代数表示细胞培养分种传代次数
细胞代数=传代数×分种数/2 X=(logN-logNo)÷log2 X 代数 N 培养最终细胞数 No 培养起始细胞数
第五章动物细胞制药
2020/12/11
第五章动物细胞制药
第三章 动物细胞制药
第五章动物细胞制药
第一节 概 述
细胞学说的建立 组织培养和细胞培养 细胞工程学
第五章动物细胞制药
第二节 动物细胞的形态和生理特点
一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞
第五章动物细胞制药
MRC-5： 从正常男性肺组织中获得的人二倍 体细胞系。
核型为2n=46。 属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。
有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38 快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人 的病毒敏感。用于生产疫苗。
第五章动物细胞制药
Namalwa： 从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取， 建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率， 12～14条标记染色体。单条X，无Y。培养基 为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产 α干扰素。
第五章动物细胞制药
Sf-9： 1983年从亲代IPLB—SF21AE中克 隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分 离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其 它杆状病毒高度敏感。
通常用的培养基为Grace培养基，添加 3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液, 10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。
淋巴细胞。
第五章动物细胞制药
⒉二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细 胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有 一定特征的细胞株。
第五章动物细胞制药
二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。
第五章动物细胞制药
⒊转化细胞系
倍增时间=培养经过时间÷代数
第五章动物细胞制药
⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制 现象。
⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。
原代培养 有限细胞系 无限细胞系
第五章动物细胞制药
⒋动物细胞对周围环境十分敏感.
各种理化因素：渗透压、pH、离子浓度、 剪切 力、微量元素等。
⒌动物细胞对培养基要求高
必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、 葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。
第五章动物细胞制药
二、动物细胞的化学组成和代谢
v 1.动物细胞的化学组成
v 2.动物细胞的代谢
第五章动物细胞制药
三、动物细胞的生理特点
⒈ 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12～48h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）
第五章动物细胞制药
G1期：4～6h 合成DNA聚合酶 RNA合成
第五章动物细胞制药
⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功 能与细菌不同。
动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体：合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面糖蛋白。
第五章动物细胞制药
动物细胞生产药物
缺点:培养条件高、成本贵、产量低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译