第七章 蛋白质的分离纯化

Kd可以有下列几种情况：
(1)当Kd=O时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝 胶内部的大分子物质(全排阻)，洗脱体积等于空 隙容积(组分I)。 (2)当Kd=1时，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全渗入凝 胶内部时，洗脱体积应为外水体积与内水体积之 和(组分Ⅲ)。

(3)当0<Kd<1时，Ve=Vo+KdVi。表示内水体积只有 一部分可被组分利用，扩散渗入，Ve即在Vo与 Vo+Vi之间变化(组分Ⅱ)。 (4)有时Kd>1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时 Ve>Vo+Vi，例如一些芳香族化合物的洗脱容积 远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd>1， 如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在Sephadex G25中的Kd值分别为1.2，1.4和2.2。
硫酸铵沉淀蛋白质主要与盐浓度有关，硫酸铵浓 度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为 百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这 是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现 相当大的非线性体积变化。
操作流程：
蛋白质溶液 加入硫酸铵 静止沉淀
离心或过滤
收集沉淀
蛋白质的盐析
盐溶
盐 析
离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少， 应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析 结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质 量。 例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所 得的最低相对分子质量是35200。用其他方 法测得的Mr是69000，所以每分子牛血清清 蛋白含有两个色氨酸残基。

渗透压法

蛋白质在等电点的溶解度最小
蛋白质分子上的电荷与疏水区
疏水区域

等离子点：在没有其他盐类干扰时，蛋 白质质子供体基团解离出的质子数与质 子受体基团结合的质子数相等时的pH,为 蛋白质特征常数。
二、蛋白质分子量及其确定方法

蛋白质相对分子量在6000～1 000 000之 间。测定分子量的主要方法有化学组成法、 渗透压法、超离心法（沉降分析法）、凝 胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
第二节 蛋白质分离纯化及含量测定
蛋白质分离纯化的总目标: 增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质 重量中目标蛋白质的含量或生物活性） 蛋白质分离纯化的基本原则: 选择好的材料 了解目的蛋白质的稳定性 探索有效的抽提法和浓缩法 建立一套层析的组合 以较好的方法贮存

四、蛋白质的沉淀
消除稳定蛋白质的因素，就会导致蛋白 质沉淀。通常进行蛋白质沉淀的方法有以 下几种： 1. 盐析法 2. 有机溶剂沉淀法 3. 重金属盐沉淀法 4. 生物碱试剂和某些酸沉淀法 5. 热变性沉淀法 前两种方法可以使蛋白质不变性，后3种 方法通常会使蛋白质变性。
蛋白质的盐析
盐溶
盐 析




Ff(摩擦力) = fν = f(dχ/dt) 通过测定沉降界面的移动速度测定Mr. dx/dt为 常数 F c- F b = F f
(dχ/dt) mp（1-υ ρ ） = 2χ ω f

沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数， 用s表示。
s=(dx/dt)/ω 2χ= mp(1-υ ρ )/f
元素原子量(分子分子量 )

最低相对分子量=
元素(分子)百分含量
肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可 按下式算出： Fe原子量(55.8 ) 最低相对分子量= Fe元素百分含量 (0.335%) =16700

真实分子量是最低相对分子质量的n倍，这 里n是每个蛋白质分子中铁原子的数目。因 为肌红蛋白中，n＝l，所以其真实Mr 就是 16700。又如血红蛋白含铁也是0.335%， 即最低Mr亦为16700，但根据其他方法测得 的Mr是68000。可见每一分子血红蛋白含有 四 个 铁 原 子， 即 n ＝ 4， 因 此 其 真 实Mr ＝ 16700×4 = 66800。
聚蔗糖（Ficoll）
8%
12%
16%
20%
3、凝胶过滤 也称分子排阻层析、分子筛层析，这 是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化 蛋白质的一种方法。
二、依据溶解度差别的纯化方法
1、盐析法 在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐， 使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2SO4、 NH4Cl等。 中性盐对球状蛋白的溶解度有显著的影响： 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 盐析：高浓度的中性盐，如饱和(NH4)2SO4使 蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出。
蛋白质的盐析

分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋 白质溶液中的几种蛋白质分段析出： 鸡蛋清中球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和 度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。
1 I miZ i2 2

在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有 硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化 钠和磷酸钠等，其中以硫酸铵最为常用。 因为硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系 数小(在25℃ 时，溶解度为767g／L；0℃ 时，溶解度为697g／L)、不影响酶的活性， 分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸 铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离 子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时 也用其他中性盐进行盐析。
渗透压是溶液的依数性 质之一,是单位体积内溶 质质点数的函数,与溶质 的性质和形状无关。
唐南平衡影响渗透压测定。 尽量采用接近等电点的缓冲液作膜内外 的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。
沉 降 速 度 法
Fb Ff Fc

蛋白质在离心场中沉降时: Fc(离心力) = mpω2χ（离心加速度） Fb(浮力) = Vpρ ω2 χ= mpυ ρ ω2χ
logM = a-bμR
三、蛋白质的胶体性质

具有胶体的一切特性（布郎运动、丁达 尔现象、不能透过半透膜、具有吸附能 力）
亲水胶体稳定性 ：（1）直径1-100nm； （2）水化层（3）双电层 溶胶（蛋白质颗粒分散在水中）、凝胶 （水分散在蛋白质颗粒中）

蛋白质的胶体性质
蛋白质溶液是一种胶体溶液； 特定的空间构象，分子量一定 分子筛 层析； 在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两 种电荷 等电点沉淀，盐溶，盐析，电 泳，离子交换层析等； 一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲 水区域 有机溶剂沉淀，疏水层析。
也叫凝胶过滤层析

在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内 部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外， 而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔 网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱 外，从而使样品中分子大小不同的物质 得到分离。
A.小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞 留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之 间迅速通过。 B.(1)蛋白质混合物上柱； (2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大 分子则被排阻在颗粒之外，大小分子开始分开； (3)小分子被滞留，大分子向下移动，大小分 子完全分开； (4)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分 子尚在行进中。
有效分配系数Kav

已知
Kd=（Ve-Vo）/Vi，将Vt-Vo代替Vi，
则Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）
即 Ve= Vo+ Kav（Vt-Vo）

实际上，将原来以水作为固定相(Vi)改为水与 凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固定相，而洗脱剂(Ve-Vo) 作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较 小，而对交联度大的凝胶差别大。 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时， 当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被 洗出来，这一点为凝胶层析法的特点。
蛋白质分离纯化的步骤及具体方法
一、初(粗)提 组织、细胞破碎 缓冲液提取。 二、粗分级分离 （粗纯化） 盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 超滤浓缩等 三、细分级分离 （精纯化） 分子筛层析 亲和层析 疏水/反相层析 离子交换层析 吸附层析 电泳等 四、结晶
最低M=元素(分子)分子量/ 元素(分子)百分含量 渗透压法: Mr=cRT/Π 超离心法: Mr=RTs/[(1-υ ρ )D] 凝胶过滤: logMr =K1- K2Ve SDS－PAGE法: logMr=α -bμ R 氨基酸序列分析计算

化学组成法:
化学组成测定最低相对分子量
Vt
Vt-Vo 或 Vi+Vm
Vo

Vo：外水体积，可用不被凝胶滞留的大分子物 质的溶液(最好有颜色以便于观察，如血红蛋 白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚 糖一2000等)通过实验测量求出。
Vi：内水体积，可由g·WR求得(g为干凝胶重， WR为凝胶的“吸水量”，以mL／g表示)。 Vm ：凝胶基质体积。 Vt：总体积。 Vt = Vm + Vo + Vi
1S=1×10-13（s）
由于蛋白质分子的沉降速度同时受到分子的大小
和形状的影响，大小与质量有关、而形状与其扩散 系数有关： mp = Mr/N f = RT/ND （爱因斯坦-萨德兰德方程） s = mp(1-υ ρ )/f
RTs Mr = —————— D（1－ υ ρ ）

ρ 是溶剂的密度（g/cm3 ）；υ 是蛋白质 的偏微比容（即当加入1g干物质于无限大 体积的溶剂中时溶液体积的增量）（蛋白 质溶于水的偏微比容约为0.74 cm3/g）； R是气体常数（8.314 J/(K·mol)）；T是 绝对温度（K）；s为沉降系数；D是扩散 系数。
沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形 状相似时，s与分子量成正比。因此s常用作生物 大分子的大小表示方法。

由于s值较小，因此用1×10-13秒表示1个沉降系 数单位（ Svedberg unit）。S值与温度和溶剂 有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏20 度，水溶液条件下的s值为标准。
凝胶过滤法测定蛋白质分子量

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。 不论是天然凝胶还是人工合成的凝胶， 它们的内部都具有很细微的多孔网状结 构。凝胶层析的机理是分子筛效应(又称 分子筛层析)，如同过筛那样，它可以把 物质按分子大小不同进行分离，但这种 “过筛”与普通的过筛不一样。
分子筛层析的工作原理
第七章 蛋白质的性质和分离纯化
Properties and Purification of Protein
目的： 1.研究蛋白质的分子结构； 2.研究蛋白质的生物功能； 3.蛋白质应用。 方法: 利用各种性质差别。
第一节 蛋白质的性质 一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质为两性电解质 蛋白质等电点 蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷， 在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时 为两性离子。蛋白质溶液处于等电点时， 溶解度最小；粘度、渗透压、膨胀性及 导电能力也降为最低值。



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Ve：为洗脱体积。
分配系数Kd

可以把凝胶层析看成是液-液分配层析。 固定相是凝胶珠内部水相（Vi），流动相 是凝胶外部水相（Vo）。Kd为样品在两相 间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同 的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只 与被分离物分子的大小和凝胶颗粒孔隙的 大小分布有关，而与柱的粗细长短无关， 也就是说它对特定物质为常数，与柱的物 理条件无关。 Kd=(Ve-Vo)/Vi
依据蛋白质性质的分离纯化方法
蛋白质分子的大小 蛋白质溶解度 蛋白质电荷状况 蛋白质吸附性质 蛋白质生物学亲和性

一、依据分子大小不同的纯化方法
1、透析和超滤 透析：分离无机盐、 单糖等小分子。
超滤：分离无机盐、
单糖等小分子。
透析示意图
2、密度梯度离心
蔗糖 1.28g/cm3
4%

logMr =K1- K2Ve
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 测定分子量
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂， 可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。 SDS带有很多负电荷，与蛋白质结合（1.4克 SDS/1克蛋白质）后，SDS的负电荷远远超过了蛋 白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就 变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全 取决于蛋白质分子的大小。 在SDS和巯基乙醇存在下，蛋白质和亚基的肽链 完全伸展成长棒状（1.8nm），其分子量与肽链的 长度成比例。