第09章 酶免疫试验
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既参与高度特异的免疫反应，又起到生物催化放大 作用。 酶免疫试验测定的结果就是通过酶与显色底物或发 光底物的相互作用来最终指示的。 常用标记酶有辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（ ALP）。
四、酶的显色底物与酶促发光底物
酶的显色底物：HRP是酶免疫试验中常用的示踪系统 ，四甲基联苯胺（TMB）是ELISA最常用的显色底物。AEC 和BCIP/NBT可产生不溶性色素。 酶促发光底物：主要标记酶有HRP和ALP，可催化相应 底物发光。常用发光底物为鲁米诺及其衍生物、AMPPD和
洗涤，就可直接将抗原抗体复合物与其他成分分离。包
括ELISA、ELISPOT、发光酶免疫试验等。
第三节 酶联免疫吸附试验
重点提示
基本原理 ELISA方法建立的基本步骤 方法类型及反应原理
一、ELISA的基本原理
将待测标本和酶标记抗体或抗原加入反应体系中，形 成固相化的抗原抗体-酶复合物；
用洗涤的方法将固相抗原抗体-酶复合物与其他成分
三、ELISA的方法类型及反应原理
（一）夹心法 双抗体夹心法
三、ELISA的方法类型及反应原理
双位点一步法
三、ELISA的方法类型及反应原理
双抗原夹心法
三、ELISA的方法类型及反应原理
（二）间接法
三、ELISA的方法类型及反应原理
（三）竞争法测抗原
三、 ELISA的方法类型及反应原理
竞争法测抗体
第六节 酶免疫试验的临床应用及常用
商品试剂的方法特点
重点提示
均相酶免疫试验 异相酶免疫试验：酶联免疫吸附试验 酶联免疫斑点试验 发光酶免疫试验
一、均相酶免疫试验
临床应用：可用于吗啡、地高辛等小分子物质的检测。 方法特点：试验无需分离和洗涤程序，整个过程都在
均匀的液相中进行，具有简便、快速、利于自动化等优点。
分离；
加入酶反应底物，生成有色产物，根据呈色的深浅进
行定性或定量分析。
二、ELISA方法建立的基本步骤
待测物选择 免疫原的设计与合成 抗体的制备 ELISA方法类型的建立 对建立方法进行评价
三、ELISA的方法类型及反应原理
ELISA既可用于测定抗原，又可用于测定抗体。 有夹心法、间接法、竞争法和捕获法四种基本类型。
但应用非常局限。
二、异相酶免疫试验
（一）酶联免疫吸附试验 临床应用：用于血液及其他体液标志物的定性测定。
方法特点：基本上以聚苯乙烯塑料为固相载体，HRP
作为标记酶，显色底物多采用TMB进行显色测定。ELISA操
作简单，不需要特殊设备，ELISA结果易观察。
（二）酶联免疫斑点试验
临床应用：在监测HIV等疫苗研究免疫应答反应、移 植研究、Th0/Th1/Th2细胞转换分析、自身免疫研究、过 敏机制探讨及一些传染疾病研究。 方法特点： 灵敏度高。 检测的是单个细胞分泌。 ELISPOT操作简便经济，可以进行高通量筛选。 分析后不破坏淋巴细胞的活性，结果可以重复。
4-MUP。
第二节 酶免疫试验的分类
重点提示
均相酶免疫试验 异相酶免疫试验
酶免疫试验的分类
一、均相酶免疫试验
（一）酶放大免疫试验技术
一、均相酶免疫试验
（二）克隆酶供体免疫试验
二、异相酶免疫试验
异相EIA在抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方 法将游离酶标记物和结合酶标记物分离，其中固相酶免 疫试验最为常用。 固相酶免疫试验特点是将抗原或抗体制成固相制剂 ，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的
结合了细胞培养技术和ELISA技术。
主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定。
一、基本原理
即用抗体捕获培养细胞所分泌的细胞因子，并以酶联
免疫斑点显色方式将其表现出来。
二、数据处理及结果报告
ELISPOT检测的最终数据是细胞频率，即在细胞群体 中，受某种特异性抗原刺激而分泌某种细胞因子的阳性细
胞比例。
斑点形成细胞（SFC）数目可在显微镜下或采用酶联
三、 ELISA的方法类型及反应原理
竞争法（加中和抗原）检测抗体
三、 ELISA的方法类型及反应原理
竞争法（间接包被抗原）检测抗体
三、 ELISA的方法类型及反应原理
（四）捕获法
第四节 酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
ELISPOT是从单细胞水平检测分泌抗体来自百度文库胞或分泌细 胞因子细胞的检测技术
酶催化和分解底物发光。
由光检测仪检测发光强度，最后通过标准曲线计算出
被测物的含量。。
二、化学发光酶免疫试验
HRP标记的酶促发光反应
通常采用的反应体系是鲁米诺/H2O2/HRP/增强系
统。
二、化学发光酶免疫试验
ALP标记的酶促发光反应
三、荧光酶免疫试验
最常用标记酶是ALP。 最常用底物是4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP）。
第一章 血液标本采集与处理
临床免疫学检验技术
第九章 酶免疫试验
王宏志
目 录
第一节 酶免疫试验的组成要素 第二节 酶免疫试验的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 酶联免疫斑点试验 第五节 发光酶免疫试验 第六节 EIA临床应用及常用商品试剂的方法特点 第七节 影响酶免疫试验的主要因素
第一节 酶免疫试验的组成要素
斑点分析仪自动化进行。
第五节 发光酶免疫试验
LEIA
LEIA反应原理与ELISA相似，主要不同在于LEIA中酶 作用的底物为发光底物。
常用标记酶为HRP和ALP
根据酶促发光底物的不同，可分为化学发光酶免疫试
验（CLEIA）和荧光酶免疫试验（FEIA）。
一、基本原理
用参与催化某一发光反应的酶来标记抗体（或抗原）。 在抗原抗体反应后加入发光底物。
重点提示
固相载体 包被抗原或抗体 酶结合物 酶的显色底物与酶促发光底物
一、固相载体
微孔板：一般均使用聚苯乙烯塑料。 磁微粒：结合容量大，分离步骤简单迅速。 膜载体：包括NC膜、PVDF膜等，吸附能力较强。
ELISA板
二、包被抗原或抗体
直接包被：直接吸附于固相载体表面
ELISA：用碳酸盐溶液稀释包被抗体或抗原，加到微
（三）发光酶免疫试验
临床应用：用于标本中微量物质的自动化定量检测。 方法特点：
灵敏度高。
线性范围宽。
系统测试速度快。
检测系统直接发光。
第七节 影响酶免疫试验的主要因素
主要影响因素
试剂盒原材料因素 标本因素
实验室环境因素
操作因素
本章小结
掌握： 固相载体种类、包被抗原或抗体方法、酶结合物及底
物
ELISA的基本原理 ELISA常用方法类型及反应原理 ELISPOT基本原理及数据处理和结果报告 发光酶免疫基本原理及反应类型
孔板中4℃过夜或者37℃ 2小时，常用牛血清白蛋白或小
牛血清进行封闭。 ELISPOT：用磷酸盐缓冲液稀释包被抗体，加到底部 覆以PVDF膜等的微孔板中4℃过夜，常用脱脂乳封闭。
包被抗原或抗体
间接包被：间接吸附于固相载体表面 亲合素-生物素化抗体（抗原）模式 葡萄球菌蛋白A（SPA）-抗体模式
三、酶结合物
四、酶的显色底物与酶促发光底物
酶的显色底物：HRP是酶免疫试验中常用的示踪系统 ，四甲基联苯胺（TMB）是ELISA最常用的显色底物。AEC 和BCIP/NBT可产生不溶性色素。 酶促发光底物：主要标记酶有HRP和ALP，可催化相应 底物发光。常用发光底物为鲁米诺及其衍生物、AMPPD和
洗涤，就可直接将抗原抗体复合物与其他成分分离。包
括ELISA、ELISPOT、发光酶免疫试验等。
第三节 酶联免疫吸附试验
重点提示
基本原理 ELISA方法建立的基本步骤 方法类型及反应原理
一、ELISA的基本原理
将待测标本和酶标记抗体或抗原加入反应体系中，形 成固相化的抗原抗体-酶复合物；
用洗涤的方法将固相抗原抗体-酶复合物与其他成分
三、ELISA的方法类型及反应原理
（一）夹心法 双抗体夹心法
三、ELISA的方法类型及反应原理
双位点一步法
三、ELISA的方法类型及反应原理
双抗原夹心法
三、ELISA的方法类型及反应原理
（二）间接法
三、ELISA的方法类型及反应原理
（三）竞争法测抗原
三、 ELISA的方法类型及反应原理
竞争法测抗体
第六节 酶免疫试验的临床应用及常用
商品试剂的方法特点
重点提示
均相酶免疫试验 异相酶免疫试验：酶联免疫吸附试验 酶联免疫斑点试验 发光酶免疫试验
一、均相酶免疫试验
临床应用：可用于吗啡、地高辛等小分子物质的检测。 方法特点：试验无需分离和洗涤程序，整个过程都在
均匀的液相中进行，具有简便、快速、利于自动化等优点。
分离；
加入酶反应底物，生成有色产物，根据呈色的深浅进
行定性或定量分析。
二、ELISA方法建立的基本步骤
待测物选择 免疫原的设计与合成 抗体的制备 ELISA方法类型的建立 对建立方法进行评价
三、ELISA的方法类型及反应原理
ELISA既可用于测定抗原，又可用于测定抗体。 有夹心法、间接法、竞争法和捕获法四种基本类型。
但应用非常局限。
二、异相酶免疫试验
（一）酶联免疫吸附试验 临床应用：用于血液及其他体液标志物的定性测定。
方法特点：基本上以聚苯乙烯塑料为固相载体，HRP
作为标记酶，显色底物多采用TMB进行显色测定。ELISA操
作简单，不需要特殊设备，ELISA结果易观察。
（二）酶联免疫斑点试验
临床应用：在监测HIV等疫苗研究免疫应答反应、移 植研究、Th0/Th1/Th2细胞转换分析、自身免疫研究、过 敏机制探讨及一些传染疾病研究。 方法特点： 灵敏度高。 检测的是单个细胞分泌。 ELISPOT操作简便经济，可以进行高通量筛选。 分析后不破坏淋巴细胞的活性，结果可以重复。
4-MUP。
第二节 酶免疫试验的分类
重点提示
均相酶免疫试验 异相酶免疫试验
酶免疫试验的分类
一、均相酶免疫试验
（一）酶放大免疫试验技术
一、均相酶免疫试验
（二）克隆酶供体免疫试验
二、异相酶免疫试验
异相EIA在抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方 法将游离酶标记物和结合酶标记物分离，其中固相酶免 疫试验最为常用。 固相酶免疫试验特点是将抗原或抗体制成固相制剂 ，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的
结合了细胞培养技术和ELISA技术。
主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定。
一、基本原理
即用抗体捕获培养细胞所分泌的细胞因子，并以酶联
免疫斑点显色方式将其表现出来。
二、数据处理及结果报告
ELISPOT检测的最终数据是细胞频率，即在细胞群体 中，受某种特异性抗原刺激而分泌某种细胞因子的阳性细
胞比例。
斑点形成细胞（SFC）数目可在显微镜下或采用酶联
三、 ELISA的方法类型及反应原理
竞争法（加中和抗原）检测抗体
三、 ELISA的方法类型及反应原理
竞争法（间接包被抗原）检测抗体
三、 ELISA的方法类型及反应原理
（四）捕获法
第四节 酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
ELISPOT是从单细胞水平检测分泌抗体来自百度文库胞或分泌细 胞因子细胞的检测技术
酶催化和分解底物发光。
由光检测仪检测发光强度，最后通过标准曲线计算出
被测物的含量。。
二、化学发光酶免疫试验
HRP标记的酶促发光反应
通常采用的反应体系是鲁米诺/H2O2/HRP/增强系
统。
二、化学发光酶免疫试验
ALP标记的酶促发光反应
三、荧光酶免疫试验
最常用标记酶是ALP。 最常用底物是4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP）。
第一章 血液标本采集与处理
临床免疫学检验技术
第九章 酶免疫试验
王宏志
目 录
第一节 酶免疫试验的组成要素 第二节 酶免疫试验的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 酶联免疫斑点试验 第五节 发光酶免疫试验 第六节 EIA临床应用及常用商品试剂的方法特点 第七节 影响酶免疫试验的主要因素
第一节 酶免疫试验的组成要素
斑点分析仪自动化进行。
第五节 发光酶免疫试验
LEIA
LEIA反应原理与ELISA相似，主要不同在于LEIA中酶 作用的底物为发光底物。
常用标记酶为HRP和ALP
根据酶促发光底物的不同，可分为化学发光酶免疫试
验（CLEIA）和荧光酶免疫试验（FEIA）。
一、基本原理
用参与催化某一发光反应的酶来标记抗体（或抗原）。 在抗原抗体反应后加入发光底物。
重点提示
固相载体 包被抗原或抗体 酶结合物 酶的显色底物与酶促发光底物
一、固相载体
微孔板：一般均使用聚苯乙烯塑料。 磁微粒：结合容量大，分离步骤简单迅速。 膜载体：包括NC膜、PVDF膜等，吸附能力较强。
ELISA板
二、包被抗原或抗体
直接包被：直接吸附于固相载体表面
ELISA：用碳酸盐溶液稀释包被抗体或抗原，加到微
（三）发光酶免疫试验
临床应用：用于标本中微量物质的自动化定量检测。 方法特点：
灵敏度高。
线性范围宽。
系统测试速度快。
检测系统直接发光。
第七节 影响酶免疫试验的主要因素
主要影响因素
试剂盒原材料因素 标本因素
实验室环境因素
操作因素
本章小结
掌握： 固相载体种类、包被抗原或抗体方法、酶结合物及底
物
ELISA的基本原理 ELISA常用方法类型及反应原理 ELISPOT基本原理及数据处理和结果报告 发光酶免疫基本原理及反应类型
孔板中4℃过夜或者37℃ 2小时，常用牛血清白蛋白或小
牛血清进行封闭。 ELISPOT：用磷酸盐缓冲液稀释包被抗体，加到底部 覆以PVDF膜等的微孔板中4℃过夜，常用脱脂乳封闭。
包被抗原或抗体
间接包被：间接吸附于固相载体表面 亲合素-生物素化抗体（抗原）模式 葡萄球菌蛋白A（SPA）-抗体模式
三、酶结合物