甘露醇

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (3): 285–292,

doi: 10.3724/SP .J.1259.2011.00285 ——————————————————

收稿日期: 2010-10-18; 接受日期: 2011-01-14 基金项目: 国家自然科学基金(No.30900973) * 通讯作者。E-mail: wzc@

甘露醇对拟南芥基因组DNA 甲基化的影响

杜亚琼, 王子成*

河南大学生命科学学院植物种质资源与遗传工程实验室, 开封 475004

摘要 以拟南芥(Arabidopsis thaliana )为材料, 研究不同浓度甘露醇处理下拟南芥幼苗生长发育及其基因组DNA 的甲基化

水平和变化模式。结果表明, 用50、100、150和200 mmol·L ―1

甘露醇处理拟南芥种子会对拟南芥幼苗的形态特征和生长态

势产生影响; 甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析表明, 经50、100、150

和200 mmol·L ―1

甘露醇处理后, 基因组DNA 甲基化比率分别为17.75%、21.15%、15.49%和46.10%。甘露醇处理使拟南

芥发生基于DNA 甲基化水平和模式改变的表观遗传变异。与对照相比, 在50、100、150和200 mmol·L –1甘露醇处理下拟南芥幼苗基因组DNA 的甲基化和去甲基化比率分别为5.78%、15.48%、10.71%、33.73%及10.98%、5.36%、8.33%、7.69%。由此推测, 5-甲基胞嘧啶百分含量随着甘露醇胁迫的增强而发生不同程度的变化。 关键词 拟南芥, DNA 甲基化, 甘露醇, MSAP

杜亚琼, 王子成 (2011). 甘露醇对拟南芥基因组DNA 甲基化的影响. 植物学报 46, 285–292.

甘露醇(mannitol)是一种植物组织相容性溶质, 对植物培养细胞无毒害, 在生理学研究中可被用作组织液吸收剂, 被认为是比PEG26000更好的水分胁迫因子(赵宇玮等, 2005)。研究发现, 甘露醇预处理比低温预处理和对照能明显地提高大麦(Hordeum vulgare )花粉粒存活率和质量, 有利于进一步分裂形成胚状体和愈伤组织; 并能明显提高大麦花药培养愈伤组织诱导率、绿苗分化率及绿苗产量(刘辉等, 2009)。甘露醇高渗处理可促进根癌农杆菌对石斛兰(Dendrobium )的转化效率(冯莹和赖钟雄, 2009)。在进行植物组织培养时, 添加一定浓度的甘露醇可以抑制植物的生长, 因而甘露醇被普遍用来保存种质资源, 保存时间为1–2年。而Harding(1994)发现高渗透胁迫能够影响植物DNA 甲基化, 甘露醇处理可影响马铃薯(Solanum tu-berosum )基因组DNA 和rDNA 的甲基化状态。

DNA 甲基化是表观遗传学研究的热点之一。在生物进化历程中, 甲基化参与了越来越多的生物学过程, 包括基因的表达调控、胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、X 染色体失活等(Zilberman, 2008)。植物的表观遗传调控如DNA 甲基化, 不改变DNA 序列, 而通过对基因组进行可塑性的修饰, 使植物能够相对快速地适应新的环境条件(Causevic et al., 2005)。DNA

甲基化水平的降低对植物的一些重要性状会产生极为重要的影响, 非生物胁迫能够造成全基因组和特定位点胞嘧啶甲基化水平的升高或降低(Lukens and Zhan, 2007)。植物在应对环境胁迫时甲基化水平的改变是动态的, 如铝(Choi and Sano, 2007)、重金属(Aina et al., 2004)和水分胁迫(Labra et al., 2002)也会造成全基因组和特定位点胞嘧啶甲基化水平的增加或降低(Zhao et al., 2010)。

目前, 有关甘露醇对植物基因组DNA 甲基化的影响尚未见报道。为此, 本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana )为材料, 通过用不同浓度甘露醇处理拟南芥种子, 测定处理后植株的形态特征及生长态势, 并采用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive am- plification polymorphism, MSAP)方法分析其对拟南芥CCGG 位点胞嘧啶甲基化水平和模式的变化造成的影响, 为从DNA 水平上揭示植物对甘露醇处理的反应机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以拟南芥(Arabidopsis thaliana )Col-0生态型为实验

·研究报告·

286 植物学报 46(3) 2011

材料。甘露醇为分析纯, 购于天津市化学试剂三厂。

1.2 培养条件与处理方法

取干燥的种子经75%乙醇表面消毒30秒, 再用0.1%升汞表面消毒5–8分钟, 用无菌水冲洗6–8次后, 点种于MS固体培养基(MS盐+3%蔗糖+0.6%琼脂, pH5.8)上。于4°C条件下春化3天, 光照条件为16小时光照/8小时黑暗, 温度18–22°C, 光照强度为150 μmol·m–2·s–1, 相对湿度为80%, 于培养间培养2周后备用。将甘露醇直接加入MS培养基中, 甘露醇浓度分别为50、100、150和200 mmol·L–1, 对照为无甘露醇的普通MS培养基, 灭菌后使用。用甘露醇处理14天, 每个处理100株, 重复3次。生长2周的幼苗从培养皿转移到蛭石:营养土=1:1(v/v)的土壤中, 于培养间培养。用透明塑料罩遮盖, 保持幼苗处于湿度较高的环境。约2周后摘掉罩子, 9周后收获成熟种子。

1.3 生长状况测定

统计点种1–6天时的萌发率。甘露醇处理21天后, 测定幼苗的形态特征和生长态势。每个处理100株, 重复3次。

1.4 DNA提取

幼苗培养14天后进行DNA提取。每一处理分别取30–40株幼苗的嫩叶混合。采用CTAB法(Micheli et al., 1994)提取DNA。去除RNA纯化后的DNA质量和浓度检测采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法。DNA样品于−20°C冰箱中保存备用。

1.5 MSAP分析

MSAP分析操作过程参照何艳霞等(2007)所述方法。分子标记检测所用的接头及引物均由上海生工公司合成。

2结果与讨论

2.1 甘露醇对拟南芥幼苗生长发育的影响

统计不同浓度甘露醇处理后拟南芥种子的萌发率。结果表明, 在50和100 mmol·L–1甘露醇处理下种子萌发率与对照无显著差异, 而150和200 mmol·L–1甘露醇处理则抑制种子萌发(图1)。甘露醇处理可影响拟南芥幼苗的形态特征和生长态势(图2)。甘露醇处理造成幼苗水分胁迫, 致使植株较矮, 株型紧凑; 叶面积小, 叶狭长, 叶片薄; 根毛显著伸长, 根系发达, 向四周

图1 不同浓度甘露醇处理的拟南芥种子萌发率

Figure 1 The germination rate of Arabidopsis seeds treated by different concentrations of mannitol

图2 不同浓度甘露醇处理21天的拟南芥幼苗

(A) 0 mmol·L–1; (B) 50 mmol·L–1; (C) 100 mmol·L–1; (D) 150 mmol·L–1; (E) 200 mmol·L–1

Figure 2 Arabidopsis seedlings grown for 21 days treated by different concentrations of mannitol

(A) 0 mmol·L–1; (B) 50 mmol·L–1; (C) 100 mmol·L–1; (D) 150 mmol·L–1; (E) 200 mmol·L–1