微生物检验的基本操作技术
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1、形态结构和培养特性观察
1）、在固体培养基上，观察： 菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶
性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特 征及迁移性等； 2）、在液体培养中： 表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等； 3）、半固体培养基穿刺接种：
观察运动、扩散情况。
1.点状 2.圆形 3.丝状 4. 不规则形 5.假根状 6.纺锤 状
d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及 表面特征（光滑、颗粒、皱状）；
e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则 主要观察是否产酸和有无气体。
5）、穿刺接种法（半固体接种）
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以 用于观察细菌的某些生化反应。 （1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管； （2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中 心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能 完全刺到管底），接种针应沿原路退出； （3）经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长， 线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清， 或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细 菌有动力。
③ 处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随 意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无 菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干
（1）取菌技巧 D
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip
(用力插紧)
（1）取菌技巧 D
3. 按钮压至第一段 (不 可压至最底)
4. 深入液面下 2 ~ 4 mm
（1）取菌技巧 D
5. 慢慢释放按钮，即可 吸取液体
（2）接种技巧
1）、平板划线分离法
图4-2 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
平板划线分离法--分区划线分离法
（1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线, 再在2、3……区依次划线；
（2)每划完一个区域，转动培养皿约70度角，并将
接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域；
（5）取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内 管）；最后将接种环经火焰灭菌放好；
（6）做好标识，置35℃培养 箱中培养18~24小时。
斜面培养一般形成均匀一
致的菌苔。一般可观察表
面、透明度、色泽等特征。
大肠杆菌斜面
金黄色葡萄球菌斜面
4）、液体接种法（肉汤接种）
（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管； （2）灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在
1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培 养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌 等；
2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物 的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏 蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器 皿灭菌、操作方法等。
3.无菌操作原则
1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌 区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用 肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；
无菌操作技术
无菌操作
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
2、微生物检验过程中的无菌操作要求
（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；
（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放； （3）、在正火焰上方操作； （4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）、在接种培养物时，协作应轻、准； （6）、不能用嘴直接吸吹吸管； （7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置.脐状
12.边缘整齐 13.波状 14. 裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状
（1）取菌技巧A
5. 试管前端过火，盖上試管盖
6. 接种环烧 红灭菌
（1）取菌技巧 B
1.(方法二：平板反面拿起)
2. 自 平板 上取单一菌 落 (方法一：盖子微开遮 住培养基，避免空气中菌 体掉入)
（1）取菌技巧C
1. 挤出安全 吸球內空气， 插上灭过菌之 玻璃吸管
2. 向上为吸 ，向下为放
第六章 微生物检验的基本操作技 术
第一节 无菌操作
一、无菌操作技术 1、定义 是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵
入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污 染的操作技术和管理方法； 无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是 保证微生物实验准确和顺利完成的重要环 节。
2、内容
无菌操作技术主要包括两方面：
针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接 种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要 用到涂布棒。
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
3、微生物检验常见接种方法
• 划线接种法 • 斜面接种法 • 涂布接种法 • 液体接种法 • 半固体穿刺接种法
（3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1～2次，
使接种量逐渐减少，以获得单个菌落； （4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。
2）、斜面接种法
主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移 种，以及观察细菌的某些培养特征。
以菌种移种为例，其接种方法是： （1）取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无
净. 3.无菌器材 （1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等； （2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作
台、手等。
。
（3）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅； 无菌操作台上只允许摆放以下物品：
物品 酒精灯
数量 1个
物品 灭菌平皿
数量 10块
打火机
1个
试管架
2副
接种针 消毒棉球
洗耳球 镊子 油性笔
4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌 或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通 过火焰消毒；
5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属 丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；
6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不 得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在 开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
• 分离纯化：在进行菌种鉴定时，所用的微生物一 般均要求为纯的培养物，得到纯培养的过程称为
分离纯化。包括倾注平板法、涂布平板法、 平板划线法等等。
2、倾注平板法（倒平板）
将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，
然后分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右 的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动 培养皿，使培养基均匀分布，待凝固之后，把 这平板倒置在恒温培养箱中培养。单一细胞经 过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成 悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。 整个操作过程应严格按照无菌操作。
名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于 外侧，培养基管位于内侧； （2）右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接 种环； （3）以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞 （先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次；
斜 面 接 种 操 作
（4）将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌 少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向 上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线， 直至斜面上方顶端；
接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体 调和，使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般 以18~24小时培养后观察生长特征。
肉汤培养可观察如下几项：
a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛； b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均 匀混浊、有颗粒、絮状生长；
c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾 性）；
2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行 接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打 开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具 应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手 直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子 等；
3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位， 使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或 平皿边；
三、微生物的培养方法
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决 定外，还受到许多外界因素的影响，如 营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ 等。微生物的种类不同，培养的方式和 条件也不尽相同。通常分为：
• 一般培养法（需氧培养） • 厌氧培养法 • CO2培养法
1、一般培养法（需氧培养） 培养温度:25~37℃
液体接种
半固体穿刺
营养肉汤：液体变混浊
半固体琼脂培养基（0.5%）：扩散生长
二、分离纯化
1、几个定义
• 混和培养物：含有一种以上的微生物培养物称为 混和培养物（Mixed culture）；
• 纯培养：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一 个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）；
二、无菌操作的环境要求
• 无菌室 • 超净工作台 • 无菌器材
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间； （2）无菌室的消毒和防污染 • 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）； • 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）； • 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进
行消毒。
（3）无菌室使用要求
1. 试管前端过火 2. 打开试管盖
（2）接种技巧
方法一：以接 种环沾菌，放
入新的培养基中 接菌
方法二：以安 全吸球吸取菌
液，放入新的培 养基中，向下排 出菌液
方法三：以
Pipetman 吸取
菌液，按钮压至 最底排出菌液
（3）错误示范
试管直放，空气中菌体 容易掉入
操作時离火源遥远
（3）错误示范
→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气 (N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。
厌氧手套箱
3、二氧化碳培养法
1）烛缸法 2）二氧化碳置换法 3）化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与
浓盐酸0.35亳升加入。 4）二氧化碳培养箱法
二氧化碳培养法
烛缸法
化学法
二氧化碳培养箱
四、微生物常规鉴定技术
2、厌氧培养方法 （1） 简易的厌氧培养法：
A、 庖肉培养法 B、铁丝圈厌氧培养法 C、焦性没食子酸法 （2） 厌氧罐法 （3） 厌氧手套箱法
• 厌氧缸法 厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成
厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内
培养。 • 厌氧罐法： 装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空
安全吸球倒放，菌液 容易流入吸球內
安全吸球随意放置桌面，菌 液容易流出至桌上
（3）错误示范
Pipetman 倒放，菌液容 易流入 Pipetman 內
第二节、微生物的接种、分离纯化 和培养技术
一、接种
1、接种定义 • 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基
上或活的生物体内的过程叫做接种； 2、接种工具 • 在实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种
1个
灭菌吸管
根据需要
1瓶
电子称
1台
1个
250ml灭菌三角 瓶
2个
1个
培养基
根据需要
1支
混匀器
1台
三、无菌操作的基本技术
1、无菌接种操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具 （如接种针和吸管等）在无菌条件下接种 含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于 培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
在实验室检验中的各种接种必须是无 菌操作。
① 无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消 毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；
② 无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用 室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m 处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不 得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔 两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢， 以减少紫外线穿透的影响；
来苏尔溶液的消毒桶内消毒。
3、无菌操作技术详细图解
（1）取菌技巧 （2）接种技巧 （3）错误示范 （4）注意事项
（1）取菌技巧A
接种环在火焰上充分烧 红（接种柄，一边转 动一边慢慢地来回通 过火焰三次）
（1）取菌技巧 A
2. 试管前端过火 3. 打打试管盖
（1）取菌技巧A
4. 试管斜倾，放入接种环
1）、在固体培养基上，观察： 菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶
性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特 征及迁移性等； 2）、在液体培养中： 表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等； 3）、半固体培养基穿刺接种：
观察运动、扩散情况。
1.点状 2.圆形 3.丝状 4. 不规则形 5.假根状 6.纺锤 状
d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及 表面特征（光滑、颗粒、皱状）；
e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则 主要观察是否产酸和有无气体。
5）、穿刺接种法（半固体接种）
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以 用于观察细菌的某些生化反应。 （1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管； （2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中 心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能 完全刺到管底），接种针应沿原路退出； （3）经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长， 线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清， 或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细 菌有动力。
③ 处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随 意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无 菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干
（1）取菌技巧 D
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip
(用力插紧)
（1）取菌技巧 D
3. 按钮压至第一段 (不 可压至最底)
4. 深入液面下 2 ~ 4 mm
（1）取菌技巧 D
5. 慢慢释放按钮，即可 吸取液体
（2）接种技巧
1）、平板划线分离法
图4-2 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
平板划线分离法--分区划线分离法
（1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线, 再在2、3……区依次划线；
（2)每划完一个区域，转动培养皿约70度角，并将
接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域；
（5）取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内 管）；最后将接种环经火焰灭菌放好；
（6）做好标识，置35℃培养 箱中培养18~24小时。
斜面培养一般形成均匀一
致的菌苔。一般可观察表
面、透明度、色泽等特征。
大肠杆菌斜面
金黄色葡萄球菌斜面
4）、液体接种法（肉汤接种）
（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管； （2）灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在
1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培 养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌 等；
2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物 的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏 蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器 皿灭菌、操作方法等。
3.无菌操作原则
1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌 区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用 肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；
无菌操作技术
无菌操作
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
2、微生物检验过程中的无菌操作要求
（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；
（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放； （3）、在正火焰上方操作； （4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）、在接种培养物时，协作应轻、准； （6）、不能用嘴直接吸吹吸管； （7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置.脐状
12.边缘整齐 13.波状 14. 裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状
（1）取菌技巧A
5. 试管前端过火，盖上試管盖
6. 接种环烧 红灭菌
（1）取菌技巧 B
1.(方法二：平板反面拿起)
2. 自 平板 上取单一菌 落 (方法一：盖子微开遮 住培养基，避免空气中菌 体掉入)
（1）取菌技巧C
1. 挤出安全 吸球內空气， 插上灭过菌之 玻璃吸管
2. 向上为吸 ，向下为放
第六章 微生物检验的基本操作技 术
第一节 无菌操作
一、无菌操作技术 1、定义 是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵
入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污 染的操作技术和管理方法； 无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是 保证微生物实验准确和顺利完成的重要环 节。
2、内容
无菌操作技术主要包括两方面：
针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接 种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要 用到涂布棒。
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
3、微生物检验常见接种方法
• 划线接种法 • 斜面接种法 • 涂布接种法 • 液体接种法 • 半固体穿刺接种法
（3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1～2次，
使接种量逐渐减少，以获得单个菌落； （4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。
2）、斜面接种法
主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移 种，以及观察细菌的某些培养特征。
以菌种移种为例，其接种方法是： （1）取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无
净. 3.无菌器材 （1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等； （2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作
台、手等。
。
（3）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅； 无菌操作台上只允许摆放以下物品：
物品 酒精灯
数量 1个
物品 灭菌平皿
数量 10块
打火机
1个
试管架
2副
接种针 消毒棉球
洗耳球 镊子 油性笔
4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌 或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通 过火焰消毒；
5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属 丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；
6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不 得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在 开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
• 分离纯化：在进行菌种鉴定时，所用的微生物一 般均要求为纯的培养物，得到纯培养的过程称为
分离纯化。包括倾注平板法、涂布平板法、 平板划线法等等。
2、倾注平板法（倒平板）
将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，
然后分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右 的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动 培养皿，使培养基均匀分布，待凝固之后，把 这平板倒置在恒温培养箱中培养。单一细胞经 过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成 悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。 整个操作过程应严格按照无菌操作。
名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于 外侧，培养基管位于内侧； （2）右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接 种环； （3）以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞 （先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次；
斜 面 接 种 操 作
（4）将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌 少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向 上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线， 直至斜面上方顶端；
接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体 调和，使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般 以18~24小时培养后观察生长特征。
肉汤培养可观察如下几项：
a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛； b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均 匀混浊、有颗粒、絮状生长；
c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾 性）；
2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行 接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打 开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具 应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手 直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子 等；
3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位， 使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或 平皿边；
三、微生物的培养方法
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决 定外，还受到许多外界因素的影响，如 营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ 等。微生物的种类不同，培养的方式和 条件也不尽相同。通常分为：
• 一般培养法（需氧培养） • 厌氧培养法 • CO2培养法
1、一般培养法（需氧培养） 培养温度:25~37℃
液体接种
半固体穿刺
营养肉汤：液体变混浊
半固体琼脂培养基（0.5%）：扩散生长
二、分离纯化
1、几个定义
• 混和培养物：含有一种以上的微生物培养物称为 混和培养物（Mixed culture）；
• 纯培养：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一 个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）；
二、无菌操作的环境要求
• 无菌室 • 超净工作台 • 无菌器材
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间； （2）无菌室的消毒和防污染 • 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）； • 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）； • 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进
行消毒。
（3）无菌室使用要求
1. 试管前端过火 2. 打开试管盖
（2）接种技巧
方法一：以接 种环沾菌，放
入新的培养基中 接菌
方法二：以安 全吸球吸取菌
液，放入新的培 养基中，向下排 出菌液
方法三：以
Pipetman 吸取
菌液，按钮压至 最底排出菌液
（3）错误示范
试管直放，空气中菌体 容易掉入
操作時离火源遥远
（3）错误示范
→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气 (N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。
厌氧手套箱
3、二氧化碳培养法
1）烛缸法 2）二氧化碳置换法 3）化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与
浓盐酸0.35亳升加入。 4）二氧化碳培养箱法
二氧化碳培养法
烛缸法
化学法
二氧化碳培养箱
四、微生物常规鉴定技术
2、厌氧培养方法 （1） 简易的厌氧培养法：
A、 庖肉培养法 B、铁丝圈厌氧培养法 C、焦性没食子酸法 （2） 厌氧罐法 （3） 厌氧手套箱法
• 厌氧缸法 厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成
厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内
培养。 • 厌氧罐法： 装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空
安全吸球倒放，菌液 容易流入吸球內
安全吸球随意放置桌面，菌 液容易流出至桌上
（3）错误示范
Pipetman 倒放，菌液容 易流入 Pipetman 內
第二节、微生物的接种、分离纯化 和培养技术
一、接种
1、接种定义 • 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基
上或活的生物体内的过程叫做接种； 2、接种工具 • 在实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种
1个
灭菌吸管
根据需要
1瓶
电子称
1台
1个
250ml灭菌三角 瓶
2个
1个
培养基
根据需要
1支
混匀器
1台
三、无菌操作的基本技术
1、无菌接种操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具 （如接种针和吸管等）在无菌条件下接种 含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于 培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
在实验室检验中的各种接种必须是无 菌操作。
① 无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消 毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；
② 无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用 室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m 处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不 得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔 两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢， 以减少紫外线穿透的影响；
来苏尔溶液的消毒桶内消毒。
3、无菌操作技术详细图解
（1）取菌技巧 （2）接种技巧 （3）错误示范 （4）注意事项
（1）取菌技巧A
接种环在火焰上充分烧 红（接种柄，一边转 动一边慢慢地来回通 过火焰三次）
（1）取菌技巧 A
2. 试管前端过火 3. 打打试管盖
（1）取菌技巧A
4. 试管斜倾，放入接种环