常见化学发光技术3

年 份
分 组 依 据
数据选取 分组原则及取值
评价范围
分组后， ≥3家的组别， 2011 取该项目平均值作 年至 不同 “除外均值 为本组的指定值 2012 类型 ±2SD的数 （靶值）； 年间 实验 据
检测 方法 ＜3家的组别， 则按所有方法组该 项目平均值作为该 组的指定值（靶 值）。
指定值（靶值）±10% （15%），凡在该评价范围内 判为合格。 （参照澳大利亚EQA各项目可 接受性能界限标准： CA125、HCG、Beta-2-MG均 为±10%； AFP、CEA、总PSA、CA15-3, CA19-9 均为±15% ）。
年 份
2013 年间
分 组 依 据
数据选取 分组原则及取值
评价范围
≥3家的组别，取该 指定值（靶值）±25%，凡 项目平均值作为本 在该评价范围内判为合格。 不同 “除外均值 组的指定值（靶 类型 ±2SD的数 值）； （参照部临检中心EQA各项目 实验 据 可接受性能界限标准： 检测 ＜3家的组别， AFP、HCG、CEA、总PSA、 方法 则按所有方法组该 CA125、CA19-9、CA15-3、 项目平均值作为该 Beta-2-MG均为±25%）。 组的指定值（靶 值）。
镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，与时间分辨测定 技术结合的技术。 1、镧系元素铕螯合物被激发后，产生的荧光寿命比一般 的荧光长； 2、待短寿命的本底荧光衰退后再进行测量，以此降低 样品和试剂的本底荧光干扰，提高了测定的精密度； 3、其灵敏度可高达10-18mol/L，且克服了放射性污染及 发光免疫分析方法的稳定性差等缺点。
（二）荧光酶免疫分析（FEIA）
1、利用酶标记抗原（或抗体）与待检抗原（或抗体）反
应； 2、借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定、高效的 荧光物质； 3、通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。 代表性仪器为： 法国梅里埃公司的VIDAS全自动荧光酶免疫分析系统等。
（ 三） 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）
免疫自动化使现代免疫检验具有： 准确、灵敏（可达10-17mol/L 以上） 快速（每小时可分析近200个测试） 高效（一份样品可同时检测数十个项目） 精密度（CV<5%）、稳定等优点。 以下对现代免疫分析技术及仪器进行简单介绍。
一 、酶免疫分析（EIA）
利用酶催化底物，产生一系列生化反应，生成有色物的 生物放大作用，提高抗原-抗体免疫反应的分析技术。 按是否需将已结合的和游离的酶标记物进行分离，可将 酶免疫分析技术分为： 均相和异相EIA（大部分标记免疫测定均属异相EIA。)
普通的荧光检测水平能达到ng/L至mg/L。
荧光免疫分析系统（FIA系统）的分析技术包括：
荧光偏振免疫分析（FPIA）；
荧光酶免疫分析（FEIA）； 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）。
（一） 荧光偏振免疫分析（FPIA） 荧光素标记的示踪物与分析物的复合体，经单一平面偏 振光照射后，可发出单一平面的偏振荧光。 特点： 此荧光在特定偏振面的强度与复合体受激发时的转动速 度成反比，而转动速度与分子量的大小成反比。
引入了时间分辨荧光免疫技术，有利于排除特异荧光的 干扰，并经酶促信号放大，增强了测量的特异性。 见于美国 M D 公司（Molecular Devices Corporation）的 SPECTRA max ®GEMINI XS。
二、 免疫浊度分析
利用可溶性抗原、抗体在特定的电解质溶液中特异结合， 形成一定大小的不溶的免疫复合物，使反应液出现浊度。 当反应液中保持抗体过剩时，随抗原量增加，反应液的浊 度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出样品的含 量。
评价范围
2007 年至 2010 年间
不同 分组后， ≥3家的组别， 类型 取该项目平均值作 实验 “除外均值 为本组的指定值 检测 ±3SD”后 （靶值）； 方法 数据。 ＜3家的组别， 则按所有方法组该 项目平均值作为该 组的指定值（靶 值）。
指定值（靶值）±2SD；
凡在该评价范围内判为合 格。
具有：高灵敏度、高特异性、高精密度、高稳定性、分 析速度快等优点； 时间分辨荧光免疫分析仪具有： 兼容性，可用其他厂商的各种分析试剂盒 有良好的发展前景
此原理开发的自动分析仪器有： EG & G的 Auto DELFIA （Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescence ImmunoAssay）。
（以肿瘤标志物检测为例，适合内分泌检测）
一、湖北省肿瘤标志物能力验证/室间质评活动指 定值（靶值）确定进程
自2007年始，依北京科临易检软件公司提供的室间质评软件， 借鉴部临检中心对肿瘤标志物采用的相关评价方法，在指定值（靶 值）确定上经历了如下进程：
年 份
分 组 依 据
数据选取 分组原则及取值
35.36%
57.27%
10.23%
13.68%
24.15%
肿瘤标志物室间质量评价合理选择分组方式应为：
结 论 不同类型检测试剂盒分组﹥（优于）不同类型检测仪器分组﹥ （优于）不同类型实验检测方法分组。 2014年始，肿瘤标志物、内分泌检验能力验证/室间质评活动均 采用不同类型检测试剂盒进行分组评价。
现代免疫分析技术及展望
湖北省临床检验中心 黄 鹏
为什么要讲这个专题 ？ 目的是什么？
想解决什么问题？
目前我省免疫分析技术在EQA检测方法上存在的主要问题
对所用仪器检测原理、所用检测方法不明确、不清晰。 方法编码填写错误，统计中出现分组不当等现象。
检测方法 2013年 检测方法 2013年
实验室数
此原理研发的全自动分析系统有： Beckman-Coulter 公司：Array和Immage SIEMENS的 BN系列产品
三 、荧光免疫分析（FIA）
是抗原- 抗体结合反应与荧光物质发光分析相结合的免 疫分析技术。 以双抗夹心法为例： 1、首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 2、除去未结合抗体，加受检标本，使其中的蛋白抗原 与固相抗体形成抗原抗体复合物； 3、洗涤除去未结合物，加入荧光标记的抗体，使之与 抗原特异性结合，形成抗体-抗原-抗体复合物； 4、最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
20世纪70年代，出现了免疫浊度技术； 另一项重大突破是：1975年Kohler和Milstein建立的杂 交瘤技术与单克隆抗体技术。
百度文库
现代免疫分析主要包括： 荧光免疫、酶联免疫、免疫浊度、化学发光及流式细胞 免疫等技术。 随着免疫标记技术、单克隆抗体技术、计算机技术的发 展，实验室的免疫自动化成为现实。
免疫浊度测定方法包括：透射比浊法、散射比浊法。 浊度法的优点： 校正曲线稳定 简便快速 易于自动化 无放射性核素污染。
（一） 透射浊度法（Turbidimetry）
1、抗原抗体复合物，使介质浊度发生改变； 2、光线通过抗原抗体反应后的溶液，被复合物微粒吸 收； 3、透射光被吸收的量（吸光度）与免疫复合物的量呈 正相关； 4、测量透射光强度，与已知浓度的抗原对照，计算被 检测溶液抗原的含量。 优点：合适的试剂，可在生化分析仪中作全自动分析。
确定趋势
对现代免疫分析技术进行系统性回顾尤为必要
何为免疫分析法？
利用抗原抗体特异性结合反应检测标本中各种微量物质 （药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。 特点：高特异性、高敏感性
随着标记技术的发展，现代免疫学技术发生了质的飞 跃。
1941年，Coons等创立荧光素标记抗体技术； 1959年，美国学者Yalow和Berson建立了胰岛素的放射免 疫分析技术； 1966年，美国和法国学者又同时报道建立了酶免疫测定 技术；
当荧光标记的示踪物与分析物的复合体结合后，分析物 的复合体对相应大分子抗体进行竞争性结合，使游离的复合 体增多； 而复合体转动速度较高，这样在特定偏振面上检测到的 荧光强度较低，反之检测到的荧光强度就会较高。 检测在特定偏振面上的荧光强度的高低，得到待检血清 中分析物的浓度。
优点：灵敏度高，线性范围广，有较好的精确度。 代表性仪器有：Abbott公司的IMX、AXSYM自动分析系统。
2、反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，与 待检抗体或抗原量成一定比例； 3、加酶反应底物后，底物可在酶作用下出现颜色反应， 颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
ELISA方法: 既特异又敏感。 应用此技术的自动化仪器设备包括：
罗氏公司: ES300、 Cobas Core（II） Bio-Rad 公司： CODA、EVOLIS
本组变异系数 ≤10%取平均值； 本组变异系数 ＞10%取中位数。
分组后，
二、不同类型检测试剂盒、仪器及实验检测方法 分组统计结果间的比较
比较方法一
数据采集年份
评价类型
评价条件
参照标准
2012至2013年间
1、不同类型检测试剂 盒分组情况； 2、不同类型检测仪器 分组情况； 3、不同类型实验检测 方法分组情况。
（二）微粒子酶免疫分析技术（MEIA）
反应最终形成微粒上包被的抗体-被测物-碱性磷酸酶 标记的二抗夹心复合物，将其转移到玻璃纤维柱上，用缓冲 液洗涤，再加入底物进行测定。
优点：灵敏度高、定量线性范围宽。
见于美国Abbott公司IMX与AXSYM全自动快速免疫分析系
统。
（三） 酶促放大时间分辨荧光免疫分析（EATRF IA）
所有方法 放射免疫分析 吖啶酯直接化学发光 微粒子酶免疫分析 酶联免疫吸附实验 96 1 28 2 1 酶免疫化学发光 酶联荧光法 微粒子化学发光-AMPPD标记 鲁米诺/异鲁米诺化学发光 微粒子酶免疫化学发光
实验室数
11 1 12 5 1
电化学发光（ECL)
时间分辨荧光
28
1
其他(请详述)
2
不适当的评价限及分组方法 对能力验证/室间质评结果所造成的影响
除外均值 ±2SD余下数 据。
澳大利亚室间 质评标准中的可 接受性能界限。
比较方法二
数据采集年份
评价类型
评价条件
参照标准
2012至2013年间
1、不同类型检 除外均值±2SD 测试剂盒分组情况；余下数据。 2、不同类型检 测仪器分组情况； 3、不同类型实 验检测方法分组情 况。
卫生部临检中心 室间质评标准中的 可接受性能界限。
三、湖北省肿瘤标志物检测 能力验证/室间质评活动指定值（靶值）确定的发展趋势
不同类型检测试剂盒 项 目
不同类型检测仪器
不同类型实验检测方法
超出可接受性能界限组数平均百分率（%） 采用澳大利亚 室间质评标准中 的可接受性能界 限 采用部临检中 心室间质评标准 中的可接受性能 界限
34.89%
均相：一般是指底物与催化剂同时存在于同一体系中，比如说：溶
液。 异相：一般是指底物与催化剂之间存在相界面，比如：吸附、固载 、键合于高分子树脂链、水-有机两相反应等。
EIA具有:特异、敏感的优点，最低检测限为mg/L 水平。
（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）
1、待检标本（抗体或抗原）与酶标记抗原或抗体按一定 程序与结合在固相载体上的抗原或抗体发生特异免疫反应；
四、 化学发光免疫分析（CLIA）
（一）技术优点
灵敏度高：可达pg/L至ng/L；
检测速度快：几秒钟即可产生化学发光信号，有的情况 下信号可持续几小时甚至超过一天； 操作简便 ；
试剂对人体无危害；
成为非放射性免疫分析技术中具有发展前景的方法之一。
（二）化学发光免疫分析技术的基本原理 该技术含免疫分析和化学发光分析两个系统。 免疫分析系统： 化学发光物质或酶作为标记物直接标记在抗原或抗体上， 经过抗原与抗体反应形成抗原一抗体免疫复合物。
化学发光分析系统： 1、是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物； 2、化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发 态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态； 3、发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。 根据化学发光标记物与发光强度的关系，可利用标准曲 线计算出被测物的含量。
（二） 散射浊度法（NepHelometry）
1、一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原 抗体复合物微粒； 2、光线被微粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发 射光的波长和抗原抗体复合物大小、多少密切相关； 3、散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测物越 多，形成的复合物越多，散射光强度越强； 4、仪器通过微电脑对测量数据自动分析处理，即可得 知待测抗原的含量。