基因转化方法与转基因植株鉴定

Transferring genes into plant cells by cointegration using T-DNA，Ti plasmids，and agrobacterium
1 农杆菌感受态细胞的制备

（1）挑取农杆菌（EHA105）单菌落接种于2.0 ml YEB 培养液中，28℃培养过夜。 （2）取400µ l 菌液置于50ml YEB 液体培养基中，28℃， 220 rpm，培养5-6 hr，培养置OD600 达到0.3~ 0.5 。 （3）菌液倒入5.0ml 的离心管中，4℃，4000~5000 rpm 离心3 min。 （4）菌体悬浮于2ml 0.15M NaCl，10000 rpm 离心3 min。 （5）用1ml预冷的20mM CaCl2 轻轻悬浮，置于4℃， 24 hr内现用。
2 表达载体向农杆菌的转化



（1）取200µ l农杆菌感受态细胞，加入10~20µ l 质粒DNA，冰浴30min。 （2）液氮中速冻3~5min，37℃水浴5min。 （3）加入1mlYEB培养液，28℃，150rpm，培 养4hr。 （4）10,000rpm 离心30sec，去上清。 （5）再加入200µ lYEB 培养液悬浮细胞，涂布 于YEB 平板（含适量抗生素），28℃培养2d。
（6）生根培养

待抗性芽长到3cm，移入生根培养基， 2~3周后可观察到幼根长出。
转 化 植 株 生 根 筛 选
生根培养基： MS基本培养基+200mg/L Kan+ 250 mg/L Cef
（7）移栽
将生根良好的植株从三角瓶中小心取出， 避免损害根茎，用水冲去多余的琼脂， 移入用水浸透的灭菌土中（蛭石：营养 土=1：3）。
电泳用RNA样品的准备
----RNA加样缓冲液： 35ul 37%甲醛 100ul 甲酰胺 5ul 20XMOPS 20ul 10xDye 合计 160ul ----4ul RNA样品（ 4ul DEPC或甲酰胺中溶解 10-20ugRNA） ----- 加入16ul RNA加样缓冲液，混合 ----- 65oC加热10分钟 ----- 冰中放置5分钟

该方法可用于任何开花植物，将供体总 DNA的片断，在受体自花授粉后一定时 期涂抹于柱头上，使能沿着花粉管通道 进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞。 实际应用时一般切除柱头进行涂抹，这 样可减少DNA 进入胚囊的距离，提高转 化率，但会影响结实率。
转基因植物的鉴定
转基因植物的鉴定
1.
遗传鉴定
直接鉴定DNA分子是否整合 到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交）
柄部，置于无抗生素的MS固体培养基上，
28℃预培养2d。
（3）用于转化番茄的农杆菌菌液的准备

挑取农杆菌单菌落接种于YEB液体培养 基（100mg/L Kan和25mg/L Rif）中， 28℃振荡培养至OD600 约0.6~0.8， 5000rpm离心集菌5min，用MS重新悬浮 菌体，并将菌液稀释10倍。

叶 盘 法 转 化 番 茄 体 系 的 优 化
激素适宜浓度的筛选
分化激素浓度（mg/L） ZT 6-BA 6-BA 2.0 2.0 1.0 生长素（IAA）浓度（mg/L） 0.2 0.2 0.1 不定芽的分化率(%) 89 85 78
叶 盘 法 转 化 番 茄 体 系 的 优 化
农杆菌适宜稀释浓度的筛选
叶 盘 法 转 化 番 茄 体 系 的 优 化
乙酰丁香酮对转化率的影响
在侵染的菌液和筛选培养基中均加入了200μ M的乙酰 丁香酮，根据观察结果，加入乙酰丁香酮的外植体与 对照相比其分化情况没有明显差异，表明加入乙酰丁 香酮与否不能有效提高番茄突变体Chloronerva的转化 率。
适宜Kan浓度的筛选
以Kan浓度(mg/L)50、75、100为筛选梯度
Kan浓度为75和100mg/L的培养基上，多数外植体开始变 白，而在Kan浓度为50mg/L的培养基上，大部分外植体 还保持绿色，不定芽的分化较好。
叶 盘 法 转 化 番 茄 体 系 的 优 化
适合于番茄突变体Chloronerva的遗传转化体系
转化番茄抗性芽筛选
抗性芽由平皿转入瓶中培养
筛选培养基：MS+ ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L+ Kan 50mg/L +Cef 250mg/L
筛 选 植 株 生 根 培 养
A Chloronerva
B 35S::MxNas1
生根培养基：1/2MS+Kan25mg/L +Cef 250mg/L
基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、 样品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下： DNA微弹的制备 DNA-微弹载体的制备 靶外植体准备 DNA微弹轰击 轰击后外植体的培养

基因导入方法:
三、电击法 (Gene transfer by electroporation)
四、花粉管通道法
烟 草 抗 性 愈 伤 的 筛 选
转化1天
转化2周
筛选培养基： MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ 200mg/L Kan+ 250 mg/L Cef
转化6周
转 化 烟 草 抗 性 芽 筛 选
筛选培养基： MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ 200mg/L Kan+ 250 mg/L Cef

花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然 的花粉管通道（ 又叫花粉管引导组织），经珠 心通道，将外源DNA 携带入胚囊，转化受精 卵或其前后的生殖细胞（ 精子、卵子），由于 它们仍处于未形成细胞壁的类似“ 原生质体” 状态，并且正在进行活跃的DNA 复制、分离 和重组，所以很容易将外源DNA 片段整合到 受体基因组中，以达到遗传转化之目的。
-----不同的植物用于Southern杂交的 DNA量不同，一般每泳道的拟南芥DNA的 用量为10-25ug. -----一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶 量，DNA的浓度不要过高。注意不同的酶 要求的反应温度不一样。 -----酶切后取少量样品检测酶切是否完全， 如果不完全，可加酶后继续酶切。
10mg/ml EtBr 10XDye: 50% Glycerol, 1mMEDTA, 0.4%溴酚兰， 0.4%二甲苯青FF, 用DEPC处理水调制 20XSSPE or 20XSSC,
变性凝胶制备
-----电泳槽用5%过氧化氢处理2个小时以上， DEPC处理水清洗2次。 -----灭菌、RNA专用瓶中加入80mlDEPC处理 水及1.2克琼脂糖，微波炉加热溶解，60oC水 浴上放置15分钟，加入5ml20xMOPS及15ml 甲醛溶液，灌胶。与通风橱中进行。
RNA电泳
把制作的凝胶置于电泳槽中，加1XMOPS 缓冲液 （用20XMOPS继DEPC处理水配置） 5V/cm,预电泳5-10分钟 于凝胶孔中加入热变性后的RNA样品 3-4V/cm，电泳1-2两个小时 电泳结束后，用比例尺照相
--------------
转膜

10XSSPE 或10XSSC
固定：0.05M NaOH 处理5分钟，或UV 或80oC1.5-2小时
（1）预培养条件：培养基为MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，培养 时间2d。 （2）共培养条件：培养基为MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，28℃ 黑暗培养2d。 （3）筛选培养条件：培养基MS+ ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L+ Kan 50mg/L +Cef 250mg/L。 （4）生根培养条件：生根培养基采用：1/2MS+Kan25mg/L +Cef 250mg/L。
转膜
一般用尼龙莫 一般实验室多采用毛细管法 转膜缓冲液一般为10X的SSC或SSPE, 转膜时间一般为48hr。用UV确认转膜是否完全。 固定： UV 0.4M NaOH, 80oC烘烤1.5-2小时
Upward capillary transfer
400g
5-8cm
二、 Northern blot
1、菌液原液：侵染后不久外植体失绿，变灰暗，并且逐渐萎蔫。
2、稀释10倍：外植体有较多的愈伤及不定芽的分化。
3、稀释20倍：外植体有愈伤及不定芽的分化，但不如10好。
农杆菌适宜侵染时间的筛选
侵染时间分别为5min、10min和20min：
随着农杆菌侵染时间的延长，番茄子叶外植体受到的伤害 也逐渐加大，以至不能正常分化出不定芽。根据结果认为 5min是较适宜的侵染时间。
利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交
2.
表达鉴定
3.
表型分析鉴定
一、Southern blot检测

检测拷贝数
Southern blot 制作探针： ----- 根据试剂盒的要求确定DNA用量， 一般不超过100ng. ------ 反应结束后对探针最好用层析柱进 行纯化
DNA酶切
（4）侵染、共培养

将经过预培养的叶片放置于稀释10倍的 菌液中，侵染5min，期间不断摇动。取 出外植体，用滤纸吸干多余菌液，置于 无抗生素的培养基上共培养（28℃暗培 养2d）。
（5）抗性芽筛选

经共培养2d的叶片转入含抗生素的培养 基上，三周左右长出不定芽和愈伤组织， 每2~3周继代培养一次。
3 Leabharlann Baidu性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB 液体培养液（含有100µ g/ml Kan 和 125µ g/ml Rif）中，28°C振荡培养过夜； 小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板 进行PCR扩增鉴定。
4、遗传转化(叶盘法)

（1）无菌苗的获得（试验材料）
（2）预培养

取预出真叶的无菌子叶，剪去叶尖及叶
从植物中提取RNA 方法1. 热酚法 试剂： 提取缓冲液：
TE缓冲液饱和酚 氯仿 4MLiCl 乙醇 75%乙醇 300mM醋酸钠（pH5.2)
100mM LiCl 1%SDS 100mMTris-HCl (p8.0) 10mMEDTA
试 剂
0.05%DEPC H2O (1LH2O中加入0.5ml DEPC, 摇动混合4小时 以上，120oC, 灭菌30分钟） 20XMOPS: 0.4M MOPS 0.1M CH3COONa 0.02M EDTA pH 7.0 ---500ml 20XMOPS 中，加大约 5.5克KOH后，慢慢调至pH7.0. 120oC, 灭菌45分钟. 37%甲醛 甲酰胺（-20oC保存） 30%过氧化氢
基因转化方法与转基因 植株鉴定
目的(外源)基因的导入

(1)农杆菌介导的遗传转化 (2)DNA理化转移方法 电融合法(电激法) 基因枪法 微注射 超声波处理法 (3)种质系统转化法 主要包括花粉管通道法、胚囊及子房注射法 和生殖细胞浸泡法。
基因导入方法:
一、农杆菌介导的 基因导入(植物细胞)
DNA凝胶电泳
根据酶切后的目的片断大小，一般采用 0.7或0.8%的agarose。但当酶切后 目的片断较小时，要适当提高胶的浓 度。记住电泳时两边的泳道要加标准 分子标记。 电泳是电压不要过高， 一般为1v/cm。 最好电泳完毕后进行染色。 电泳完毕要用比例尺对胶进行照相。
对胶的后处理： 1.如果片断较大（〉15kb)，凝胶需在0.2M HCl 中处理10分钟 2.用水漂洗凝胶，加入1.5M NaCl, 0.5M NaOH, 处理45分钟，并轻轻摇动。 3.用水漂洗凝胶，与1M Tis-HCl,(pH7.4),1.5M NaCl,轻轻摇动，中和15分钟，
A 突变体Chloronerva
B 转化植株
转基因番茄互补突变体Chloronerva表型
转化植株生根后转入土培
转化小金海棠
转基因烟草表型分析
转基因烟草表型分析
MxIRT1 转化拟南芥
基因导入方法:
二、基因枪法(Biolisticbombardment)(植物细胞)

基因枪（particle gun）又称微弹轰击法 （microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。 1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系 统。