亲和纯化

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• 2.4 温度 • 由于温度升高使分子和原子的热运动加 剧，结合部位的静电作用弱。但温度上 升可使疏水性相互作用增强.
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• 2.5 离液离子 • 在SCN-，I-和CIO4-等离子半径较大的离 液阴离子存在下，疏水相互作用降低。 • 因此，如果疏水相互作用对亲和结合的 贡献较大，则添加这些离子会降低亲和 结合作用。
• 1.4 配位键 • 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位， 则两者之间可通过金属配位键间接结合。
• 例如羧肽酶(carboxypeptidase)与其底物的 结合需要通过锌原子产生配位键。过渡金 属离子Cu2+，Zn2+和Ni2+等可与组氨酸的咪 唑基产生配位键，形成金属螯合结构。
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• 1.5弱共价键 • 弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键， • 如氨基与甲酰基之间形成的Schiff碱(Schiff base)，醛基与羟基之间形成的半缩醛基 (hemiacetal)均为可逆共价键，结合力较弱。 当亲和作用分子对之间满足形成弱共价键 的条件时可能形成弱共价键。
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• 生物分子间的这种特异性相互作用称为生 物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用 (affinity)，通过亲和作用发生的结合称为特 异性结合(specific binding)或亲和结合 (affinity binding)。
• 利用生物分子间的这种特异性结合作用的 原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲 和纯化技术(Affinity purification)，其代表 为亲和层析法(Affinity chromatography)。
第八章 亲和纯化
概念
利用生物分子间特异性结合的原理进行物质分 离纯化的技术称为亲和纯化技术(Affinity purification)，其代表性的方法为亲和层析法 (Affinity chr与该物 质的分子相结合的能力。这种识别并结 合的能力具有排他性，即生物分子能够 区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一种分子相结合。
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• 1.3 疏水性相互作用 • 如果亲和作用分子对的一方分子上含有芳 香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部 位上也含有疏水区，则两者之间可发生疏 水性相互作用。
• 蛋白质的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲 硫氨酸和脯氨酸等氨基酸残基含有碳氢链， 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基含有芳香 环，这些氨基酸残基如暴露在结合部位， 则与另一分子的疏水基发生疏水性相互作 用。 11
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• 1.2氢键
• 如果亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或 氮原子，结合部位之间可以产生氢键作用，即形 成O…H—O (0.26nm)或O…H—N (0.28～0.30nm)。
• 由于氧和氧或氧和氮原子与氢原子必须基本排列 在一条直线上，并且原子之间的距离达到一定程 度时才能产生氢键，因此氢键的产生与否受结合 部位之间位置关系的严格制约。
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• 1.1静电作用
• 亲和作用分子对的结合部位上带有相反电荷时， 产生静电引力。
• 在中性pH下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷 氨酸和半胱氨酸等酸性氨基酸残基可带负电荷， 而精氨酸、赖氨酸和组氨酸等碱性氨基酸残基 可带正电荷。
• 此外N末端氨基酸的—氨基带正电荷，C末端氨 基酸的羧基带负电荷。
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• 2.2 pH
• 蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离 基团，不同解离基团的解离常数(pKa)不同。 • 如果静电引力对亲和结合作用的贡献较大， 则pH将严重影响亲和作用，即在适当的 pH下亲和结合作用较高，而在其他pH下 亲和结合作用减弱或完全消失。
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• 2.3 抑制氢键形成的物质
• 脲和盐酸胍(guanidinohydrochloricacid)的 存在可抑制氢键的形成。 • 因此，如果亲和结合作用中存在氢键，则 加入脲或盐酸胍可减弱亲和作用。 • 但是，脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂， 高浓度下容易引起蛋白质的失活或变性。
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• 蛋白质分子表面的凹陷或凸起部位与 整个蛋白质分子相比要小得多，由于 不是整个分子或物质参与亲和结合， 亲和作用的分子(物质)对可以是：大 分子—小分子，大分子—大分子，大 分子—细胞，细胞—细胞。
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• 具有亲和作用的分子(物质)对之间具 有“钥匙”和“锁孔”的关系。 • 除此之外，还需要分子或原子水平的 各种相互作用才能完整地体现亲和结 合作用。这些相互作用包括以下几个 方面。
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• 2.6 螯合剂 • 如果亲和结合作用源于亲和分子对与 金属离子形成的配位键，则加入乙二 胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离 子，可使亲和结合作用消失。
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3、亲和作用体系
• 酶反应的底物特异性即反映在一种酶仅与 特定的物质(底物)相结合并催化该物质发生 的特定反应。 • 此外，酶反应的可逆竞争性抑制剂和底物 一样与酶的活性部位结合，抑制酶的活性。 由于酶反应的产物来自底物，与底物具有 某种相似性，也往往成为酶反应的抑制剂。
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二、亲和层析
• 1、原理与操作 • 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸 附介质为固定相亲和吸附目标产物，使 目标产物得到分离纯化的液相层析法。
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一、生物亲和作用
• 1、亲和作用的本质 • 亲和作用是自然界普遍存在的现象， 只是生物分子间的亲和作用具有更高 的选择性。一般如不特殊说明，亲和 作用均指生物分子间的特异性结合作 用。
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• 蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和 结合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸 起的结构，能与该蛋白质发生亲和作用 的分子恰好可以进入到此凹陷结构中， 或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入 与其发生亲和作用的分子(一般也是蛋 白质)的凹陷部位，就象钥匙和锁孔的 关系一样。
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2、影响亲和作用的因素 2.1离子强度
• 如果亲和结合作用主要源于静电引力，则 提高离子强度无疑会减弱或完全破坏亲和 作用。 • 由于氢键的形成同样基于静电引力，因此 提高离子强度也会降低或消除氢键作用。
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• 与静电引力相反，疏水性相互作用随离 子强度提高而增大。因此，当亲和结合 作用主要源于疏水性相互作用时，增大 离子强度则可提高亲和结合作用。