菌种科学保藏常用方法

六）、冷冻真空干燥保藏法
❖ 1、安瓿瓶的准备： ❖ 2、保护剂的选择： ❖ 3、冷冻干燥装置： ❖ 4、制备孢子液 ❖ 5、预冻孢子液： ❖ 6、减压干燥 ❖ 7、真空熔封：
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六）、冷冻真空干燥保藏法
❖ 1、安瓿瓶的准备： 安瓿瓶的玻璃应能经受温度的突变而不破裂，先用2
％盐酸浸泡12小时，再用清水洗涤3次，然后用蒸馏水洗 净、烤干；瓶口加棉塞，灭菌后备用。
由于真空干燥保藏的菌种是密封在安瓿瓶里的，因此不 仅邮寄运输方便，并且不会污染杂菌。此法适于能形成孢子 的菇类长期保藏，其设备和操作均较复杂。
七）、液态氮超低温保藏
❖ 将要保藏菌种的悬浮液或菌块，密封于盛 有保护剂的安瓿瓶里，先在控制的条件下致 冷，使之缓速预冻，再置于-150至-196℃液 态氮超低温冰箱中保藏。
国内主要的菌种保藏机构
3、CICC 中国工业微生物菌种保藏管理中心: 我国唯一的国家级工业微生物菌种资源保藏管 理中心，保藏各种工业微生物菌种资源包括：细菌、 放线菌、酵母菌、丝状真菌和大型真菌，共67个属 251种，近3000株，库藏备份80000余支。 http://www.china-cicc.org/
四）麸皮保藏法
❖ 亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入孢子，然后 在低温干燥条件下保存。
❖ 其制作方法将麸皮与水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌匀， 装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的 菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥 剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥 后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。
国内、国际常用的菌种保藏法
❖ 我国常采用的菌种保藏法：
斜面低温保藏 、液体石蜡保藏 、冷冻干燥法、 液氮超低温法。
❖ 国际（ATCC）常采用的方法：
冷冻干燥法（5-15年）、液氮超低温法（20 年）。
斜面低温保藏(定期移植法)
这是一种常用最简便的保藏方法。
为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时 琼脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氢二钾、磷 酸二氢钾及碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产 生的有机酸。可以用无菌胶塞代替棉塞，既能防止 污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥
❖ 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。 因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物 研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛 曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。
五）、蒸馏水保藏法：
这是保存斜面菌种和孢子最简单的方法，有效期可达1 年以上。
1、斜面蒸馏水贮藏： 在无菌条件下，将无菌蒸馏水倾注入需保藏的斜面菌
6、减压干燥：将预冻时附在这瓿瓶管上的冰水揩干，立 即放入干燥器中抽真空。
六）、冷冻真空干燥保藏法
7、真空熔封：菌种安瓿瓶经减压干燥后，应立即取出安装在 封口用的玻璃抽气管上，进行抽气熔封管口。边抽气，边用 煤气或酒精灯的细火焰，对准安瓿瓶中央，即可熔断封口。 熔封时应注意火焰，不宜过大。
安瓿瓶菌种启用时，在无菌操作下打开这瓿瓶，加入0.3～0.5 毫升的无菌生理盐水或1％麦芽汁即可使用。
国内主要的菌种保藏机构
2、CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心: CGMCC的宗旨是广泛收集国内外的微生物资 源，妥善保存，以公开的保藏机构的名义为工农业 生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供标准化 的实验材料,在保证生物安全和保护知识产权的前提 下，为第三者能够自由地利用各种微生物材料提供 服务，最大限度的实现微生物资源的保护、共享和 持续利用。http://www.cgmcc.net
此法保藏孢子，寿命可达2～10年，使用时 在无菌条件下，挑取少许砂土孢子，抖撒在PDA 斜面上，适温培养，菌丝生长后，再转管培养1 次。
1.准备砂土: 细河砂，用内径0.250～0.177毫米筛孔过筛,除去粗 粒和砂未； 红黄壤土，内径0.149毫米过筛，用磁铁衬纸吸除砂 土中铁屑，用0.05～0.1N盐酸浸泡半天，除去有机质。 然后用清水反复冲洗至酸碱度近中性后，置于60～80℃ 烘箱中烘干。 砂土比例2:1或4:1混合，分装入10毫米×100毫米试 管或安瓿瓶内，每管装量0.5克，经0.11兆帕121℃高压 灭菌30分钟，每天1次，共3次，或160℃干热灭菌1次， 保持2～3小时。灭菌后挑取少许砂土移至PDA斜面上培 养，证实无杂菌即可。
2、保护剂的选择： 保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少
在保藏过程中的死亡。保护剂种类很多，如牛马血清、无 菌牛奶等，多数菌种保藏是脱脂牛奶。
❖ 3、冷冻干燥装置： 这个装置包括1台真空泵、1付麦氏真空计、1个缓冲瓶、
1个真空干燥器（内装五氧化二磷或无水氯化钙等干燥剂） 和1个冷冻槽（内盛有1:3的食盐和碎冰块）。
5、KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 韩国典 型菌种保藏中心
6、DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ) 德国微生物菌种保藏中心
❖ 1、基因突变 ❖ 2、连续传代 ❖ 3、不良培养条件及不良保藏条件
菌种退化的防止
❖ 1、减少传代次数 ❖ 2、用单核细胞和单菌落移种传代 ❖ 3、菌种纯化 ❖ 4、采用良好培养基和培养条件 ❖ 5、科学的保藏
一、菌种保藏的目的
❖ 菌种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后， 仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、 形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。
六）、冷冻真空干燥保藏法
4、制备孢子液：用接种针挑取孢子接入盛有2～3毫升无 菌脱脂牛奶的试管中，稍加搅动即制成悬浮液。用吸管吸取 悬浮液注入安瓿瓶。每管分装约0.2毫升，注意不要溅污上 部管壁，防止杂菌污染和熔封时引起碳化。分装应在1小时 内完成，装后棉花塞好管口。
5、预冻孢子液：在冷冻干燥之前，先将孢子液的安瓿瓶， 置于低温冰箱中预冻1小时，安瓿瓶放在上述冻结剂中，只 需4～5分钟，温度便可达-70℃。
2、接种与保存：
在无菌条件下，将液体石蜡用无菌吸管移入生长健壮、 丰满的斜面菌种上，使液体石蜡高出斜面顶端1厘米左右； 最后直立放置在洁净的室温下贮藏。
转管时直接用刀切取1小块菌种，移接到新的斜面培养 基中央，适温培养，余下的菌种仍在原液体石蜡中贮藏。
三）、砂土管贮藏：
此法应用广泛，适于贮藏孢子和酵母状分生 孢子，而对菌丝体不适用。
2、接种:
干接：用接种环直接挑取孢子2～3环，拌入砂土管中
湿接：将孢子刮入5毫升无菌水的试管内，充分摇匀，制 在孢子悬液，然后用1毫升吸管吸取悬液，每管中加入0.2毫升。
3、贮藏：
干接法制成的砂土管，直接放在盛有无水氯化钙、变色硅 胶或生石灰的广口瓶内保存：
湿接法制成的砂土管，用真空泵抽气8～10小时，使之干 燥。放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的大试管内，加橡皮塞， 放置4～6℃冰箱中贮藏。
二、菌种保藏的原理
❖ 菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空 气（真空）和断绝营养、加保护剂等手段， 以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑 制微生物的生长与繁殖。
❖ 由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休 眠状态，所以能够保藏较长时间。
三、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏 （定期移植法） 2、液体石蜡保藏 3、砂土管贮藏 4、 麸皮保藏法 5、悬液保藏 ： 1）生理盐水保藏法；2）蒸馏水保藏法： 6、冷冻真空干燥保藏法 7、液氮超低温保藏法 8、甘油保藏法
种内。加水量需高出斜面顶端1～2厘米，更换无菌橡皮 塞，直立置于4～6℃冰箱内贮藏。 2、孢子蒸馏水贮藏：
无菌条件下提取少许孢子，移入试管无菌蒸馏水内，换 上橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱内贮藏。
若保存时间较长，中途需补充无菌蒸馏水。使用时从 管内挑取菌种块或蘸取孢子悬液，移接至新的斜面培养基 上活化培养。原试管加塞后仍可继续贮藏。
❖ 优点：保存时间可长达数年至数十年；适用 范围广，对一些即使不耐低温菌种，如草菇 等，也可在保护剂的保护下进行超低温保存； 此外，经保藏的菌种基本上不发生变异。
国内、国际常用的菌种保藏法
❖ 我国常采用的菌种保藏法： 斜面低温保藏 、液体石蜡保藏 、冷冻干燥法、
液氮超低温法。 ❖ 国际（ATCC）常采用的方法： 冷冻干燥法（5-15年）、液氮超低温法（20
国外主要菌种保藏机构
2、NBRC (NITE Biological Resource Center)： 日本 技术评价研究所生物资源中心
3、NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) ： 美国农业研究菌种保藏中心
4、CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心
国外主要菌种保藏机构
1、ATCC(American Type Culture Collection） 美国典型菌种保藏中心:主要从事农业、遗传学、应用 微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方 法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物 学、分类学、食品科学等的研究。该中心保藏有藻类111株， 细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌 和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物 1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒 1563种。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。 该中心保藏的菌种可出售。
国内主要的菌种保藏机构
4、GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心: 成立于1987年，隶属于广东省微生物研究所，主要从事 微生物菌种资源分离、收集、保藏和应用研究。中心设有普 通微生物菌种库和专业微生物菌种库，保藏有可用于科研、 教学、生产的菌种约2500株，基本覆盖了环境、工业、农业、 分析、食、药用真菌行业各类生产和科研用微生物，保藏的 菌种具有热带亚热带特色，其中许多优良菌株的生产性能具 有较高水平。广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心是华 南地区最大、最专业的菌种保藏中心。 http://www.gimcc.net/index.asp
六）、冷冻真空干燥保藏法
❖ 采用低温、干燥和真空办法，使菌种的新 陈代谢活动处于高度静止状态，也就是在极 低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在极 低温度下真空干燥，使菌体细胞结构成分保 持原来状态。因此，菌种保藏10～20年，仍 不降低其原有性能。冷冻干燥是目前应用最 广泛、效果较好的一种菌种保藏方法。
菌种保藏技术
主讲:傅文红
主要内容:
❖ 一、菌种保藏的目的 ❖ 二、菌种保藏的原理（掌握） ❖ 三、菌种保藏的方法（重点）
什么是菌种衰退？
生产菌株性状的劣化或遗传标记的丢失： ❖ 1、菌落形态的改变 ❖ 2、生长速度缓慢 ❖ 3、生产能力下降 ❖ 4、抗不良环境能力减弱（抗噬菌体、低温等）
菌种退化原因
年）。
国内主要的菌种保藏机构
1、CCTCC 中国典型培养物保藏中心 (China Center for Type CultureCollection，简 称CCTCC):CCTCC保藏的微生物包括细菌、放线 菌、酵母菌、真菌、单细胞藻类、人和动物细胞系、 转基因细胞、杂交瘤、原生动物，地衣，植物组织 培养、植物种子、动植物病毒、噬菌体、质粒和基 因文库等各类微生物（生物材料/菌种）。 http://www.cctcc.org/
细菌：1个月，酵母菌3个月，放线菌、霉菌半 年。
二）、液体石蜡法
操作简便，只要在菌苔上灌注一层无菌 的液体石蜡Biblioteka Baidu即可使菌种与外界空气隔绝， 达到防止培养基水分散失，抑制菌丝新陈代 谢，推迟菌种老化，延长菌种生命和保存时 间的目的。
此种方法也称为隔绝空气保藏法。
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❖ 具体方法：
1、石蜡的准备：
选用化学纯液体石蜡100毫升，装入250毫升锥形瓶内， 置于0.11兆帕灭菌30～60分钟；然后置于160℃烘箱中处理 1～2小时；或置40℃温箱内3天左右，见瓶内液体石蜡呈澄 清透明，液层中无白色雾状物时即可。其目的是使灭菌时进 入瓶内的水分得到蒸发。