关于细菌的一些荧光原位杂交(FISH)的资料

阿哈湖深层水中微生物和硫酸还原菌数量及群落结构空间变化
本文章中细菌FISH操作流程：
材料方法：
1.样品采集
于2006年6月使用Niskin采样器，从18m深度开始按1m间距采集贵州阿哈湖水深22m处的深层湖水，共采集5个样品（编号为Aha06101-Aha06105），样品立即用45多聚甲醛进行固定。

2.主要试剂和仪器：
多聚甲醛（Sigma，美国）；明胶（Oxiod，美国）；丫啶橙（Sigma，美国）；DAPI （Sigma，美国）；荧光显微镜（Olympus，日本）。

3.荧光探针
采用EUB338和SRB385寡核苷酸探针，5’端Cy3标记（表1），由上海生物工程技术服务有限公司合成。

表1 16S rRNA 探针的靶细菌种属和探针序列
探针名称序列（5’-3’）检测的微生物
EUB338 GCT GCC TCC CGT AGG AGT 真细菌
SRB385 CGG CGT CGC TGC GTC AGG 硫酸盐还原菌
4.荧光原位杂交法对阿哈湖深层水环境总微生物、真细菌和硫酸盐还原菌数量的分析
4.1 样品预处理取1ml样品用直径25mm GTTP滤膜过滤后，1 ml PBS 洗涤3次后，0.5ml 50%、80%和99.5%乙醇分别洗涤，每次3min，风干。

4.2 原位杂交湿盒中适量加入杂交缓冲液（EUB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1Tris-Hcl，0.01% SDS，20% formamide；SRB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，35%甲酰胺），将包被有明胶的玻片放于湿盒中，膜放于玻片上。

25ng·μl-1探针4μl和杂交缓冲液20μl混匀后，滴加于膜上，38℃ 90min；取出膜放入洗涤液中50℃20min （EUB探针洗涤液0.18mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，
5mmol·L-1 EDTA；SRB探针洗涤液0.40mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，5mmol·L-1 EDTA）水洗膜，风干；&O &- /7·/? K -的<1=> 4& "? 复染，避光-0 /*$，水洗，风干。

4.3 镜检将膜放于油镜下观察。

在EUB探针和SRB探针杂交的实验中，采用WG滤光片，计数发红色荧光的菌体分别为真细菌和硫酸盐还原菌数目；采用WU滤光片，计数发蓝色荧光的菌体即为总微生物数。

每个样品均平行分析3次，取均值。

5. 丫啶橙染色对湖水微生物活性的测定
取1ml样品加入3滴0.1%丫啶橙溶液，染色3min，苏丹黑B染色的直径0.2μm滤膜过滤，水洗1次，风干。

Olympus油镜下计数，滤光片为WB。

丫啶橙与DNA结合后菌体发绿色荧光，和RNA 结合后菌体发红色荧光。

观察菌体为黄色或红色示该细菌为活性状态，而绿色为非活性状态，分析样品中活性微生物所占数量。

每个样品均平行分析3次，取均值。

产氢反应器内两种发酵类型细菌的种群结构与发酵特征
本文中FISH的操作
FISH监测：
研究结果表明，大多数产氢发酵细菌属于梭菌属(Clostridium)和肠杆菌科
( Erzterobacteriaceae ).通过查询probeBase寡核昔酸数据库，获得了它们的专一性探针以及与其他发酵菌专一性杂交的探针的寡核昔酸序列，分别为:Chis150，专一杂交Clostridium cluster I和II(序列为5’-TET-TTATGCGGTATTAATCTYCCTT-3’);C1it135，专一杂交Clostridium cluster XI(序列为5'-FITC-GTTATCCGTGTGTACAGGG-3' ).另选择探针ENT183(序列为5'-ROX-CTCTTTGGTCTTGCGACG-3')，专一杂交Euterobacteriaceae.探针的合成与荧光素标记均由Invitrogen公司完成，置于-20℃下避光保存.使用前用超纯水将探针稀释到5ng·mL-1分装备用。

实验操作如下:①取样:取反应器中的活性污泥，用灭菌玻璃珠振荡打碎，1000 r·min-1离心2min,将上清液5000一8000 r·min-1离心2min，弃上清液，再用PBS将收集到的细菌冲洗1次。

②固定:用4%多聚甲醛溶液固定，4℃过夜.杂交实验前，用PBS液清洗，离心收集.③预处理:用蛋白酶K,37℃消化30min,减少蛋白质对杂交的影响.再用溶菌酶处理l Omin，以增加细胞的通透性.最后用梯度酒精(50% ,80% ,95% ,100%)依次脱水.④杂交:探针在杂交前加人杂交液中(0. 9mol·L-1NaCI,20mmo1·L-1Tris一Cl，0.1%-1% SDS，5%一55%甲酞胺)，使其终浓度为5ng·mL-1.杂交在载玻片上进行，取经过预处理的样品10μL涂于载片，充分干燥后，加20μL杂交液，置于密闭湿盒，46℃杂交炉中避光杂交2一4h.⑤洗脱:杂交完成后，用SET 洗脱液，46℃将多余的探针除去.⑥双杂交:洗脱后，在新的杂交液中再加人另一种16S rRNA 探针溶液，按上述步骤杂交.
结果分析:全部操作完成后，加少量对苯二胺-甘油溶液覆盖样品，防止荧光淬灭，再封片.结果用Zeiss LSM共聚焦显微镜观察、照相，利用Zeiss LSM Image Browser软件进行结果分析.通过观察照片和计算荧光面积，可以获得目标菌群的相对数量和空间分布情况.
紫外辐照对活性污泥中菌群存活率的影响
2. 3实验方法
2. 3. 1菌悬液制备取曝气池中段上层泥样活性污泥60 mL置于250mL离心管中，加人直径2. 36-2. 80 mm的小玻璃珠若干，在混匀器上震荡10 min ,制成活性污泥菌悬液.
2. 3. 2 UV辐照取活性污泥菌悬液50 mL放人500 mL的烧杯中，放置烧杯至紫外灯(15 W , 264nm)垂直高度20cm处照射3 min,辐照过程中始终用磁力搅拌器搅拌(200r·min-1).紫外辐照后室温蔽光放置30 min.
2.3.3固定新制备菌悬液和UV辐照菌悬液分别与4%的多聚甲醛溶液按3:1(体积比)比例混合，4℃下固定16 h, PBS(pH 7.2)洗涤3次，用含50 %乙醇的PBS ( pH = 7. 2)重悬.固定后的活性污泥在- 20℃条件下可保存2周.固定后的菌悬液在使用前用石英砂反复研磨后供杂交使用.
2.3.4原位杂交取适量研磨好的固定样品按1:2(体积比)的比例加人含2 ng·μL-1探针的杂交缓冲液(0. 9 mol·L-1NaCI , 0. O1 % SDS ,20mmo1·L-1Tris-HCI, pH =7. 2)中，46℃下杂交3h.为了增加探针(ALF,BET,GAM和COM)杂交的严格性，在杂交缓冲液里加人了相应浓度(表1)的甲酞胺.探针BET与GAM之间只有1个碱基的差别，分别按1:1(体积比)比例加人竞争性探针UGAM和UBET，以提高杂交特异性.杂交3h后，0℃的PBS ( pH 8. 4 )缓冲液洗涤3次，1μmol·L-1的Hoechst33342重悬后，用于荧光显微镜观察和流式细胞仪检测.
2.3.5流式细胞仪的调谐与Ce1lQuest软件分析利用直径为6 μm的荧光小珠调谐，使荧光通道1( FLl -H )、侧向角荧光通道(SSC-H)和前向角荧光通道(FSC-H)的最终平均荧光强度值为100左右(线性值).荧光通道4 ( FL4-H)的调谐是利用直径2. 5μm蓝光小珠调节的，最后荧光强度变异系数CV小于5. FCM实验过程中各参数均设置于对数级.系统阂值设置在SSC-H，大小为52.实验数据的获取和分析均通过软件Ce1lQuest完成.
现代分子生物学技术在瘤胃微生态系统研究中的应用
这篇文章是一篇关于胃肠道内微生态系统的综述性文章，其中有一小段提到了FISH技术。

1.2 RNA探针
16S rRNA方法的理论和实际操作前人已有大量的报道，研究者完善地建立了利用小亚基C SSU ) rRNA-16S rRNA研究胃肠道微生态系统的方法。

这些方法也适用于23S rRNA，由于其信息量很大(3000bp)，故在技术更为成熟时，能得到更为广泛的应用。

16S rRNA保守区的互补寡核并酸可用来设计通用探针，而其可变区则用来设计成高特异性的探针，用来鉴定微生物的属或种，乃至某一菌株。

利用16S rRNA寡核井酸探针研究牛瘤胃中产琉泊酸LPL状杆菌
(Fihrobocter .succi}wgenes)和多毛毛螺菌(I,rvcb}w,spiramultipaxus)的数量与变化及其在复杂的微生物区系中的活性，结果表明，相关种的F. ,succi}wge}。

具有遗传多样性[Csl在该试验中，传统的培养计数法没有获得成功。

群特异性的16S rRNA寡核井酸探针可以用来研究不同家畜(牛、绵羊、山羊、猪)胃肠道中细菌、真核生物和占细菌的数量，试验发现这三类微生物数量的变化范围分别为60%一90%.3%30%和0.5% -3%，且发现不同动物消化道中占优势的甲烷菌是不同的[7jo Kraus。

和Russell}}〕利用探针研究了莫能霉素添加水平对瘤胃中氨基酸利用菌及其脱氨基作用的影响，探针还被用于自色瘤胃球菌(Rumiulcoccus olbus)和黄色瘤胃球菌(Rumi}wcoccus fluvefociems)在发酵纤维一糖、纤维素及碱处理麦秸时细菌间相4_关系的动力学研究。

结果表明，16SrRNA寡核井酸探针能有效地鉴定培养物中特定的细菌，而且还能提供细菌间竞争作用的一些信息[Cpl。

这些探针还被用来研究R . olbus . R . _ flave}acie}。

和F. .succi}wge}。

在底物充足或不足的环境，}’刘一纤维一糖和纤维素的竞争现象[iol黄庆生等0利川探针研究了酵母培养物刘一瘤胃细菌的影响，发现添加酵母培养物能显苦提高黄化瘤胃球菌的相刘一比例Fix}lw等[”〕利川荧光标记的16S rP}NA寡核有酸探针研究了瘤胃.}，的占细菌，证实内毛亚科(Erzto}lirzium)和反当厚毛虫} Dasytricyuz
n4mirzoaatium )的细胞液泡外含有内共生的甲烷菌SharpC }zl等利川SSU rP}NA探针研究瘤胃和体外连续培养系统，}，的微生物}x_系，均发现原虫和产甲烷菌之间有很强的4_作关系:甲烷杆菌科(Metymaaob}u t eri}ueae)是瘤胃占细菌，}，最人的一类，占89.3%，而且在99.2%的原虫碎片均有发现，体外培养48h后，随着原虫数量的下降，Metymaaob}u eriaceae占占细菌的比例降为54%但占占细菌的12.1%的甲烷微菌科(Metymaaomicrobiale)在原虫碎片，}，没有检测到，这说明Metymaaomicrobiale是游离在原虫外的。