呼吸道合胞病毒实时荧光定量PCR检测_张其威

１ 材料和方法 １．１ 毒株和细胞株 ｈＲＳＶ 标准毒 Ｌｏｎｇ 株 " 人脊髓灰质炎病毒 ! 型 由本室保存 $ 柯萨奇病毒 Ｂ 组 ２ 型由武汉大学医学
院杨占秋教授惠赠 $ 甲型 " 乙型流感病毒由中国武汉 疾病预防控制中心刘传南教授惠赠 $ 腺病毒 ７ 型购自 中国科学院武汉病毒研究所 ! ＨｅＬａ 细胞由 ＣＣＴＣＣ % 中国典型培养物保藏中心 & 提供 !
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ＺＨＡＮＧ Ｑｉ－ｗｅｉ１， ＹＯＵ Ｓｈａｎｇ－ｙｏｕ２， ＳＵＮ Ｊｉ－ｍｉｎ２， ＷＵ Ｑｉ２， ＹＵ Ｃｈｕｎ－ｈｕａ２， ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕ－ｙｕ１ １ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７２， Ｃｈｉｎａ； ２Ｗｕｈａｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ＇ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｗｕｈａｎ ４３００１６， Ｃｈｉｎａ
测试剂盒为北京美迪科生物技术有限公司生产 !
１．４ 临床标本的处理 用消毒干棉签 １ 支 # 在患儿咽腭弓处轻拭一圈 # 移入 １０ ｍｌ 尖底试管中 # 加入 １ ｍｌ 生理盐水 # 反复挤 压咽拭子 ３￣５ ｍｉｎ# 将咽拭子压在管壁上挤出残余抽 提液 # 取 ３００ "ｌ 用于病毒 ＲＮＡ 的提取 # 剩 余 的 用 于 病毒分离或 !７０ " 保存 ! １．５ 病毒培养 取咽拭子抽提液 # 接种于已达 ５０％丰度的 ＨｅＬａ 单层细 胞 # 在 ＤＭＥＭ 培 养 液 % 含 ２％ 小 牛 血 清 & 中 培 养 # 维持培养基的 ｐＨ 值在 ７．０ 左右 # 逐日观察病变 # 有 细 胞 病 变 效 应 %ＣＰＥ & 出 现 者 # 确 定 为 阳 性 $ 盲 传 ３
894%-’/%: ;9<)/%&() Ｔｏ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ （ｈＲＳＶ）． =)%>,74 Ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｎｅ ＴａｑＭａｎ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ Ｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈＲＳＶ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＬｉｇｈＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲ ｉｎ ９３ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｔｈｅ ａｓｓａｒｙ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｒｏｕｔｉｎｅ ＰＣＲ， ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ， ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）． 3)4"+%4 Ｔｈｉｓ ＴａｑＭａｎ ａｓｓａｙ ｈａｄ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １ !１０２ ｃＤＮＡ ｃｏｐｉｅｓ／!ｌ ｗｉｔｈ ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ １!１０２ ａｎｄ １!１０７ ｃＤＮＡ ｃｏｐｉｅｓ／!ｌ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ， ｂｕｔ １０ ｔｉｍｅｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｈａｎ ｒｏｕｔｉｎｅ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｈＲＳＶ ｗｉｔｈ ｐｏｌｉｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １， ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２， ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ， ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ７． Ａ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｓｉｚｅ （１９５ ｂｐ） ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｈＲＳＶ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｆｏｒ ａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ． Ｆｏｒｔｙ－ｆｏｕｒ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ （４３．９％） ｗｅｒｅ ｈＲＳＶ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ａｎｄ ４ （４／９３，４．３％） ｗｅｒｅ ｈＲＳＶ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ＥＬＩＳＡ， ｓｈｏｗｉｎｇ ｒａｔｈｅｒ ｌｏｗ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｎｏ ｖｉｓｉｂｌｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＲＳＶ ＲＮＡ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ． 2,$/+"4&,$ Ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｉｓ ｒａｐｉｄ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ， ａｎｄ ｈａｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｗｉｄｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈＲＳＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ． ?)5 @,-74: ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ； ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ； ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ； Ｔａｑｍａｎ
０２７－６８７５２８３３， Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｕｙｕｚｈ＠１６３．ｃｏｍ
( ８４８ (
第一军医大学学报 %Ｊ Ｆｉｒｓｔ Ｍｉｌ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ&
第 ２５ 卷
领 域 得 到 应 用 ! 本 研 究 将 ＦＱ－ＰＣＲ 技 术 和
１１７５ ｂｐ&# 荧光探针 ５＇ 端标记荧光报告基团 ＦＡＭ#５＇
和 ３＇ 中间标记荧光淬灭基团 ＴＡＭＲＡ#３＇ 末端经磷酸 化处理 % 图 １ &!
４３００７２ #２ 武汉市儿wk.baidu.com医院 !湖北 武汉 ４３００１６$
摘 要 ! 目 的 建 立 一 种 快 速 # 准 确 诊 断 人 呼 吸 道 合 胞 病 毒 $ｈＲＳＶ % 早 期 感 染 的 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检 测 方 法 & 方 法 以
ｈＲＳＶ 最保守的 Ｎ 基因序列为参考 ! 设计两对特异的引物和一条 ＴａｑＭａｎ 荧光探针 ! 在 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ 定量 ＰＣＲ 检测仪上
图 １ ＦＱ－ＰＣＲ 与巢式 ＰＣＲ 所用引物与探针
!"#$% &’"()’* +,- .’/0) ", 12－&34 5,6 ,)*7)6 &34
ＦＱ－ＰＣＲ： Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
１．２ 试剂 ＲＮＡ 提取试剂盒 ’Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ" 氯仿 " 异丙醇 "７５％ 的乙醇 %ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ &! 逆转录反应液组成 ’４ "ｌ ５!ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ#２．５ "ｌ ｄＮＴＰ#１．５ "ｌ 引物 Ｐｓ#１０ "ｌ ＤＥＰＣ 处理 的无菌双蒸水 ! 逆转录酶系组成 ’１ "ｌ Ｍ－ＭＬＶ 和 １ "ｌ ＲＮａｓｉｎ ! ＤＮＡ 凝胶纯化试剂盒购自上海华舜 公 司 " Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ 超 纯 质 粒 ＤＮＡ 纯 化 试 剂 盒 "Ｍ－ＭＬＶ 逆 转录酶%２００ Ｕ／"ｌ&购自 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司#ｄＮＴＰｓ%１０ ｍＭ&" Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 （２．５ Ｕ／ "ｌ） 为清华天为时代 公司产品 #ＲＮＡ 酶抑制剂 %５０ Ｕ／"ｌ &为华美公司产品 # 克 隆 用 的 ｐＭＤ １８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ 和 Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 %５ Ｕ／"ｌ & 为 ＴａＫａＲａ 公司产品 ! ｈＲＳＶ ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ 检
收稿日期 !２００４－１１－０１ 作 者 简 介 ! 张 其 威 （１９７９－） ! 男 ! 武 汉 大 学 生 命 科 学 学 院 在 读 博 士 研 究 生 ! 电话 "０２０－８１８７３８７９ !Ｅ－ｍａｉｌ "ｗｉｓｙ９８＠１６３．ｃｏｍ 通讯作者 ! 张楚瑜 ! 教 授 ! 博 士 生 导 师 ! 武 汉 大 学 生 命 科 学 学 院 ! 电 话 "
对 ９３ 例 下 呼 吸 道 感 染 患 儿 进 行 ｈＲＳＶ ＲＮＡ 检 测 ! 并 与 病 毒 分 离 培 养 ’ 常 规 ＰＣＲ# 巢 式 ＰＣＲ 方 法 和 ＥＬＩＳＡ 法 相 比 较 ( 结 果 以 ＰＣＲ 模 板 浓 度 来 定 义 ! 该 方 法 线 形 范 围 为 １!１０２￣１!１０７ ｃＤＮＡ ｃｏｐｉｅｓ／!ｌ! 灵 敏 度 达 １!１０２ ｃＤＮＡ ｃｏｐｉｅｓ／!ｌ ! 和 巢 式 ＰＣＲ 相同 ! 比常规 ＰＣＲ 高 １０ 倍 ( 用人脊髓灰质炎病毒 " 型 ’ 柯萨奇病毒 ２ 型 ’ 甲型 ’ 乙型流感病毒 ’ 腺病毒 ７ 型作对 照 ! 均无预期扩增产物和荧光的产生 ) 该方法在 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ 和 Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ 两种仪器上的定量结果具有 一 致 性 ) 采 用 该 法对 ９３ 例患儿行 ＦＱ－ＰＣＲ 检测出阳性 ４４ 例 *４３．９％ %!ＥＬＩＳＡ 方法检测阳性 ４ 例 *４．３％ %! 两者相关性不高 & ｈＲＳＶ 浓度 的高低与患儿临床症状之间的关系不是很明显 & 结论 该方法可快速 ’ 灵敏 ’ 特异 ’ 定量检测 ｈＲＳＶ ! 在 ｈＲＳＶ 感染的早 期诊断和疗效监测方面具有良好的应用前景 & 关键词 ! 呼吸道合胞病毒 ) 实时监测 ) 荧光定量 ＰＣＲ )Ｔａｑｍａｎ 中图分类号 !Ｑ９３ 文献标识码 !Ａ 文章编号 !１０００－２５８８（２００５）０７－０８４７－０６
人 类 呼 吸 道 合 胞 病 毒 *ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
目前呼吸道合胞病毒的临床检验常用病毒分离 培养法’ 免疫学方法和逆转录聚合酶链式反应 $ＲＴ－ＰＣＲ %法 & 病毒分离培养虽有 -金标准 . 之称 ! 但其 技术复杂 ’费时长 !不适合用于早期诊断 & 免疫学方法 虽然操作简便 ! 但其灵敏度和特异性变化较大 ! 容易 出现假阳性和假阴性 & ＲＴ－ＰＣＲ 法只能定性或半定量 检测 ! 无法评价治疗方案的效果 ! 且易造成产物污染 ! 无法标准化 !不利推广 & 近年来发展起来的荧光定量 ＰＣＲ *ＦＱ－ＰＣＲ% 技 术以其灵敏度高 ’ 检测速度快 ’特异性强等优点 ! 已在 病 原 体 定 性 +３, 定 量 检 测 +４,’ 肿 瘤 基 因 检 测 +５,’ 免 疫 分 析 +６,’ 基因表达水平分析 +７, 及其多态性 +８, 研究等多个
ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ!ｈＲＳＶ% 是 婴 幼 儿 下 呼 吸 道 感 染 ! 特 别
是婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的最重要的病 原之一 & 流行病学调查结果表明 ! 肺炎是我国城乡 婴幼儿死亡的首要原因 ! 占儿童死亡率的 ２０％ ) 每年
+１,
４５％￣５０％ 住院婴幼儿毛细支气管炎及 ２５％ 婴幼儿肺 炎是由 ｈＲＳＶ 直接感染所致 +２,&
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ"Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ 定 量 检 测 系 统 相 结 合 # 以 ｈＲＳＶ 最保守的 Ｎ 基因序列为参考 # 设计一对引物和
一条 ＴａｑＭａｎ 荧光探针 # 建立了定量检测 ｈＲＳＶ 的方 法 ! 该方法可望用于婴幼儿 ＲＳＶ 急性呼吸道感染的 早期诊断 # 同时也为 ｈＲＳＶ 的分子生物学研究提供了 一种新的 " 简捷有效的工具 !
２００５；２５（７）
第一军医大学学报 *Ｊ Ｆｉｒｓｔ Ｍｉｌ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ%
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呼吸道合胞病毒实时荧光定量 ＰＣＲ 检测
张 其 威 １! 游 上 游 ２! 孙 继 民 ２! 吴 旗 ２! 余 春 华 ２! 张 楚 瑜 １ "１ 武 汉 大 学 病 毒 学 教 育 部 重 点 实 验 室 ! 湖 北 武 汉