枯草芽孢杆菌培养基配方

枯草芽孢杆菌培养基配方

枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,采用L16(45)正交表,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对

其配方进行优化。试验结果表明,当培养基的配方为无水葡萄糖3.50 g/L、蛋白胨0.83 g/L、酵母膏0.50 g/L、磷酸二氢钾0.35 g/L和碳酸钙0.25 g/L,温度(34±2)℃时,培养16 h即可达到生长峰值。由于枯草芽孢杆菌光学密度(optical density,OD)与活菌数量的关系:y=0.5182x2+1.4462x+1.9714(r=0.996343),接种的枯草芽孢杆菌由1.9714×108cfu/mL提高到3.3124×108cfu/mL。优化的枯草芽孢杆菌培养基条件能有效促进枯草芽孢杆菌生长。

培养基：1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。

ph为7即可，温度30度到37度皆可——条件不是很苛刻，比较容易培养。

枯草芽孢杆菌常用培养基配方：

1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂

枯草芽孢杆菌原生质体的制备

1 培养枯草芽孢杆菌

取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。

2. 收集细胞

各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。

3. 总菌数测定

各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。

4. 脱壁

二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。

5. 剩余菌数测定

取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。

计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。