竹叶黄酮的分离提取

竹叶黄酮的分离提取、检测与成分分析

姓名：周胤潇

班级:微生物121

学号：201201220414

摘要：竹叶黄酮(Bamboo- leaf-flavonoid, BLF)是我们于上世纪90年代末创制的一种新型植物黄酮制剂,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂、扩冠和免疫增强活性等（1-2）。竹叶总黄酮以其巨大的资源优势和良好的药理活性将成为一种非常有前途的天然药物,具有广阔的开发前景.本实验主要对竹叶中黄酮类物质的含量用紫外分光法进行测定以及高效液相色谱法对竹叶提取物的成分分析。

关键词：竹叶黄酮类物质紫外分光法高效液相色谱法

前言竹子为禾本科Poaceae竹亚科Bambusoideae多年生常绿植物，在我国分布很广，资源十分丰富。竹子在建筑、水利、农业等领域都有广泛的应用，然而，竹子加工利用后，竹叶却总是被弃置，造成了极大浪费。近年来的研究发现竹叶中含有多种活性物质，其主要活性物质是黄酮类物质,含量平均在2%,竹叶提取物中的有效成分主要是以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷为代表的碳苷黄酮和以对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸为代表的植物酚酸为主，竹叶黄酮中的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素内酯,黄酮类物质是一类天然植物成分，具有显著的生理及药理活性，黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用⑶。

实验目的：

（1）掌握样品的前处理的方法

（2）掌握竹叶黄酮的提取、分离与纯化

（3）用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定竹叶子中总黄酮

（4）采用超高效液相色谱（UPLC）定量分析竹叶中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸8 个特征性成分的量。

1 实验材料和仪器

1.1实验材料：

竹叶（摘自浙江农林大学校园内）

标准样品：甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚（分析纯）、氢氧化钠、芦丁标准品（购自中国药品生物制品检定所，纯度均大于98%）、去离子水。

芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥至恒重的芦丁对照品5.600mg，加入甲醇溶液定容至50mL，配成112ug/mL的芦丁标准溶液。

5%亚硝酸钠溶液：称取约5.263g亚硝酸钠溶解在100mL去离子水，置于4℃冰箱中备用。

10%硝酸铝溶液：称取约11.111g硝酸铝溶于100mL去离子水中，置于4℃冰箱中备用

1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.000g氢氧化钠溶于100mL去离子水中，置于4℃冰箱备用。

1.2实验仪器：

40目筛

高速冷冻离心机、

旋转蒸发仪、

紫外分光光度计、

微波炉、

粉碎机、

回流装置

密封袋

ACQUITY™ Ultra Performance LC超高效液相色谱系统，包含二元溶剂管理器，样品管理器，柱温箱和二阵管阵列检测器；

Micromass Q-Tof micro TM串联质谱（美国Waters公司）

2 实验原理及方法

2.1 实验原理：

浸提、洗脱原理：

根据相似相溶原理，对所用溶剂按黄酮类化合物的极性来选择，竹叶中所含的有效活性物质主要为黄酮甙类，具有较大的极性和亲水性，故可以选择热水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行浸提。但由于水的极性过大，且易于将蛋白质、糖类的易溶于水的成分浸提出来，且水提法提取物存放易发霉，从而影响黄酮类化合物的提取和分离。故本实验选用甲醇水溶液作为浸提及洗脱溶剂⑷。

2.2工艺流程（5，6，7）

新鲜竹叶→洗净烘干→破碎→过筛（40目）→回流浸提→抽滤→悬蒸→定容→测定吸光度→分析计算

2.3实验步骤

2.3.1 竹叶处理

采集竹叶，，立刻用微波炉进行杀青干燥（微波炉，700W，间隙加热2~3次，每次60S），将烘干的竹样用粉碎机粉碎，过40目筛，将滤过的竹样粉末放入密封袋中密封，放置于-40℃冰箱中储存备用。

2.3.2 竹叶黄酮的提取与纯化

2.3.2.1 竹叶黄酮的提取

1.精确称取竹样粉末各200.00g。

2.加入150mL60%乙醇-水溶液，浸泡30min。

3.水浴锅水温75℃热回流提取1h。

4.冷却至室温，过滤，收集滤液。

5.在滤渣中加入50mL60%乙醇进行二次回流30min。

6.冷却至室温收集滤液，弃滤渣，密封，标号，置于4℃冰箱，备用。

2..

3.2.2萃取、纯化

在竹样粗提取液中加入100mL石油醚进行萃取脱脂脱叶绿素，弃上清液取下沉液，再次加入100mL石油醚进行萃取，重复2次，将提取液密封保存至4℃冰箱备用。

2.3 .2.3 浓缩干燥

将萃取过的竹叶提取液用旋转蒸发仪将其浓缩干燥，将干燥后的残渣（黄酮初提物）用60%甲醇定容至100mL容量瓶中，保存于4℃冰箱备用。

2.42.

3.4 离心

将竹叶黄酮浓缩液用离心机在转速为4000rpm，温度10℃条件下离心10min，取上清液，保存至4℃冰箱备用。

2.3.3 黄酮总含量测定----硝酸铝-亚硝酸钠比色法

标准曲线制作：精确称取经105℃干燥至恒重的芦丁标准品5.600mg，加入甲醇溶液并定容至50mL，配成112ug/mL的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1、2、3、4mL移入10mL具塞试管中，用60%甲醇定容至5mL，各加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，再加入10%硝酸铝溶液0.3mL振摇后放置6min，再加1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用60%甲醇定容至10mL，静置10min，以零管为空白，摇匀后在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、芦丁的微克数为横坐标绘制标准曲线以及求取线性回归方程。

样品黄酮含量测定：

1.取竹样黄酮提取液400uL，加入600uL去离子水稀释10倍。

2.将稀释的黄酮提取液用60%甲醇定容至5mL。

3.加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min。

4.再加入10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀后放置6min。

5.加入1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用60%甲醇定容至10mL，静置10min。

6.以零管为空白，摇匀后在510nm波长处测定吸光度。

7.根据芦丁标准曲线按公式计算黄酮总含量。

3实验结果

3.1紫外分光测定吸光度

以芦丁为标准品绘制标准曲线.芦丁溶液质量浓度X (ug/mL)与吸光度值A的关系曲线的回归方程式: A＝0.0103 X + 0.0154。取2 mL提取液于25 mL比色管中,在510 nm处测定吸光度.参比为空白试剂,并代入回归方程计算其质量浓度.

测得的A＝0.260，求得X＝23.7476 ug／mL