二十章-生物制品分析生物制品分析
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动相，根据样品在固定相和流动相中的不同保留行为 而实现高效分离的一种方法。 可以应用UV、DAD、FD、ELSD、ECD、MS等作为检测器， 分离化合物范围广泛。
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
氨基酸 天冬氨酸（Asp） * 苏氨酸（Thr） 丝氨酸(Ser) 谷氨酸(Glu) 脯氨酸(Pro) 甘氨酸(Gly) 丙氨酸(Ala) 胱氨酸(Cys) * 缬氨酸(Vla) * 甲硫氨酸(Met) * 异亮氨酸(Ile) 亮氨酸(Leu)
生物制品分析
Biopharmaceutical Analysis
【基本要求】
1 ．了解生化药物和基因工程药物定义、 种类和特点。 2．熟悉该类药物的质量检验的基本程序与 方法。 3．掌握常用的定量分析方法中的色谱分析 法。
返 回
第一节：概述
化学药物 Chemical drugs
生物药物 Biopharmaceuticals
测定法：酶联免疫吸附剂测定法－ELISA 2、外源性DNA残留量的检查 目的：防止外源性DNA对人类的危害 测定法：分子杂交技术、基于DNA结合蛋白分析系 统、实时定量PCR技术
3、产品相关杂质的检查－同系物、异构体、 降解产物等
测定法：HPLC和CE
4、残余抗生素的检查
目的：控制生物制品制备时抗生素的用量
High-performance Ion-exchange chromatography
High-performance Gel-filter chromatography
反相高效液相色谱法
基本原理：利用ODS或C18等极性较小的键合硅胶为
填料，以极性较大的methanol-water、CH3CN-H2O为流
高效凝胶过滤色谱法
根据生物药物的分子量及其极性来对成分进行分离
测定，主要用于生化药物的分离和分子量的测定研究。
分离产物可以回收、可以用少量表面活性剂来改善
分离效果、可根据化合物的形状和分子量大小来预测
出峰顺序。 具有简便、快速、重现性好、样品用量少等优点。
电泳 electrophoresis 是指溶液中带电粒子 在电 场作用下发生迁移的电动现象。 毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分 析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的 目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中
酶法
电泳法 等电点聚焦法 生物鉴别法
▲ 理化鉴别
链激酶
高效液相色谱法：
1、反相高效液相色谱法
2、分子排阻色谱法 毛细管电泳
1、毛细管区带电泳CZE
▲ 生化鉴别
第三节：杂质检查
杂 质 检 查
特殊杂质检查
安全性检查
特殊杂质检查
1、宿主细胞蛋白残留量的检查
目的：控制异源蛋白的含量以防超量后引起机体免 疫反应
酪氨酸(Tyr) * 苯丙氨酸(Phe) * 赖氨酸(Lys) 组氨酸(His) 精氨酸(Arg)
用HPLC法和氨基酸分析仪测定多维氨基
酸片中18种氨基酸
高效离子交换色谱法：主要用于蛋白质、
多肽和氨基酸等的分离分析，它是根据 相应的离子化程度对样品进行分离的， 常用盐浓度逐渐增大的方式进行梯度洗 脱的。 2～10 mmol/l的离子对试剂
效 价 测 定
含 量 测 定
HPLC
UV or Flueserence
SDS-PAGE
常用的定量分析方法及应用
理化分析法
生化分析法
生物检定法
重量法
理 化 分 析 法
化学分析方法
电化学分析法
容量分析法
光谱分析法
色谱分析法
重量法：根据样品中分离出来的单体或化合物的重
量测定所含成分的含量的方法。
能离解为离子的物质。
特
瑞典化学家Tiselius建立了“移 界电泳”，成功地将人血清中的 蛋白质分为5个主要成分，为蛋 白质化学的发展奠定了基础。
点
诺贝尔奖
优点: 操作简单，试样量少，分离效率高，成本低 等。
在迁移时间上的重现性，进样的准确性和检测灵敏
度方面比高效液相色谱法稍逊。
A平为供试品溶液的吸收度 As平为对照品溶液的吸收度 Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml） W为称样量（mg） 0.8309为校正因子 500为稀释倍数
以氨基葡萄糖 计≥24.0％
高效液相色谱法
反相高效液相色谱法 高效离子交换色谱法 高效凝胶过滤色谱法 RP-HPLC HPIEC HPGFC
Reversed-phase high-performance liquid chromatography
硫酸软骨素的比色法测定：在酸性条件下使样品 水解成氨基己糖，再在碱性条件下与乙酰丙酮和 二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物，该产物在
525 nm处有最大吸收。
具体试验操作：
1、制备对照品溶液－氨基葡萄糖 2、制备供试品溶液－硫酸软骨素 3、反应和测定－缩合反应和比色测定
A Ws 0.8309 500 百分含量（％）＝ 100% As W
致突变、生殖毒性
◆往往需要进行效价（含量）测定
生化药物和基因工程药物质量检 验的基本程序于方法
鉴别试验 杂质检查
安全性检查
效价测定
理化鉴别试验
第 二 节 ： 鉴 别 实 验
化学反应法
对比吸收光谱和特 征吸收的一致性
光谱鉴别法－UV
鉴 别 试 验
色谱鉴别法－HPLC
生物化学鉴别法
对比色谱保 留行为的一 致性
生物制品：是应用普通的生物技术获得
的微生物、细胞及组织等生物材料制备 用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
生化药物和基因工程药物的分类 氨基酸、多肽和蛋白质 生 化 药 物 酶和辅酶类 多糖类 脂质类药物 核酸及其降解产物
基 因 工 程 药 物
激素和神经递质类 胰岛素、生长激素 细胞因子类 人干扰素、人白细胞素、促红细胞生成素
*
总氨基酸含量 (g/100g) 0.44 0.24 0.19 0.60 0.20 0.30 0.27 0.02 0.30 0.06 0.23 0.40 0.15 0.26 0.68 0.11 0.31
游离氨基酸含量 (mg/100g) 1.23 1.25 0.89 7.80 1.07 0.38 0.87 0.09 0.32 1.60 0.32 1.34 0.54 0.39 4.08 1.03 2.09
中药 Traditional Chinese Medicine TCM
生物药物：是指利用生物体、生物组织或
器官等，综合运用生物学、生物化学、免
疫学和药学等原理与方法制得的一类药物。
生化药物 Biochemical drugs 生物合成药物 Biosynthetic drugs 生物制品 Biological products
豚鼠、皮肤过敏和腹腔注射
降压物质检查：检查药物中能够导致血压降低的 物质，如组胺类。
猫或狗
无菌检查：对于不能进行高温灭菌的生物药品，
必须进行无菌检查。
一些特殊污染物的检查：主要考虑外源性DNA、 一些杂蛋白等。 致突变试验：回复突变试验、染色体畸变试验等 生殖毒性试验
来自百度文库
第 四 节 ： 含 量 （ 效 价 ） 测 定
测定法：抑菌试验
常规热源和细菌内毒素的检查
异常毒性试验
安 全 性 检 查
过敏试验 降压物质试验 无菌试验 一些特殊污染物的检查 致突变试验 生殖毒性试验
异常毒性试验：是用一定剂量的药物按照指定的操
作方法和途径给予规定体重的某试验动物，观察其
极性毒性反应。
小鼠、LD50
过敏试验：是对生化药物和基因工程药物中的异性 蛋白进行进检查。
酶及凝血因子类 单克隆抗体、基因药物、反义核酸
生物制品的种类和特点
1、疫苗类药物：细菌疫苗、病毒疫苗、联合疫 苗、多价疫苗
2、抗毒素及抗血清类药物：被动免疫制剂
3、血液制品 4、重组DNA制品：细胞因子、生长因子、酶、抗 体 5、诊断制品 6、其他制品
生化药物和基因工程药物的特点
◆都是来自生物体或通过生物手段获得 ◆分子量都较大 几十KD～几千KD，不是固定值 ◆化学结构式难以确认，单单是光谱分析方法难以进行 ◆在生产过程中需要全面的质量控制 ◆在生产过程中要求进行生物活性检查 ◆ 往往需要进行安全性检查 热源、过敏、异常毒性、
提取法：用适宜的溶剂提取样品中的某成分后挥去溶 剂进行测定的方法。 挥发法：利用被测组分的挥发性，或经过衍生化后将 其转化成挥发性物质来进行测定的方法。 沉淀法：将被测组分转化成沉淀，称定沉淀的重量来 计算含量的方法。
光谱分析方法
比色法
利用样品与显色剂发生现色反应，根据反应产
物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan
生化药物：生化药物是指从动物、植物及 微生物中提取的,或采用生物化学合成和现 代生物技术制得的生命基本物质及其衍生 物、降解产物以及大分子的结构修饰物等， 如氨基酸、多肽、蛋白质等。
生物合成药物：利用现代生物技术研制的一 类药物，包括基因工程药物。 基因工程药物：在确定对某种疾病具有预 防和治疗作用的蛋白质，进而控制该蛋白质 合成过程的基因进行分离、纯化或人工合成， 利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因 导入可以大量生产的受体细胞中，在受体中 不断繁殖和表达，进而生产大规模具有复方 和治疗疾病的蛋白质。
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
氨基酸 天冬氨酸（Asp） * 苏氨酸（Thr） 丝氨酸(Ser) 谷氨酸(Glu) 脯氨酸(Pro) 甘氨酸(Gly) 丙氨酸(Ala) 胱氨酸(Cys) * 缬氨酸(Vla) * 甲硫氨酸(Met) * 异亮氨酸(Ile) 亮氨酸(Leu)
生物制品分析
Biopharmaceutical Analysis
【基本要求】
1 ．了解生化药物和基因工程药物定义、 种类和特点。 2．熟悉该类药物的质量检验的基本程序与 方法。 3．掌握常用的定量分析方法中的色谱分析 法。
返 回
第一节：概述
化学药物 Chemical drugs
生物药物 Biopharmaceuticals
测定法：酶联免疫吸附剂测定法－ELISA 2、外源性DNA残留量的检查 目的：防止外源性DNA对人类的危害 测定法：分子杂交技术、基于DNA结合蛋白分析系 统、实时定量PCR技术
3、产品相关杂质的检查－同系物、异构体、 降解产物等
测定法：HPLC和CE
4、残余抗生素的检查
目的：控制生物制品制备时抗生素的用量
High-performance Ion-exchange chromatography
High-performance Gel-filter chromatography
反相高效液相色谱法
基本原理：利用ODS或C18等极性较小的键合硅胶为
填料，以极性较大的methanol-water、CH3CN-H2O为流
高效凝胶过滤色谱法
根据生物药物的分子量及其极性来对成分进行分离
测定，主要用于生化药物的分离和分子量的测定研究。
分离产物可以回收、可以用少量表面活性剂来改善
分离效果、可根据化合物的形状和分子量大小来预测
出峰顺序。 具有简便、快速、重现性好、样品用量少等优点。
电泳 electrophoresis 是指溶液中带电粒子 在电 场作用下发生迁移的电动现象。 毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分 析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的 目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中
酶法
电泳法 等电点聚焦法 生物鉴别法
▲ 理化鉴别
链激酶
高效液相色谱法：
1、反相高效液相色谱法
2、分子排阻色谱法 毛细管电泳
1、毛细管区带电泳CZE
▲ 生化鉴别
第三节：杂质检查
杂 质 检 查
特殊杂质检查
安全性检查
特殊杂质检查
1、宿主细胞蛋白残留量的检查
目的：控制异源蛋白的含量以防超量后引起机体免 疫反应
酪氨酸(Tyr) * 苯丙氨酸(Phe) * 赖氨酸(Lys) 组氨酸(His) 精氨酸(Arg)
用HPLC法和氨基酸分析仪测定多维氨基
酸片中18种氨基酸
高效离子交换色谱法：主要用于蛋白质、
多肽和氨基酸等的分离分析，它是根据 相应的离子化程度对样品进行分离的， 常用盐浓度逐渐增大的方式进行梯度洗 脱的。 2～10 mmol/l的离子对试剂
效 价 测 定
含 量 测 定
HPLC
UV or Flueserence
SDS-PAGE
常用的定量分析方法及应用
理化分析法
生化分析法
生物检定法
重量法
理 化 分 析 法
化学分析方法
电化学分析法
容量分析法
光谱分析法
色谱分析法
重量法：根据样品中分离出来的单体或化合物的重
量测定所含成分的含量的方法。
能离解为离子的物质。
特
瑞典化学家Tiselius建立了“移 界电泳”，成功地将人血清中的 蛋白质分为5个主要成分，为蛋 白质化学的发展奠定了基础。
点
诺贝尔奖
优点: 操作简单，试样量少，分离效率高，成本低 等。
在迁移时间上的重现性，进样的准确性和检测灵敏
度方面比高效液相色谱法稍逊。
A平为供试品溶液的吸收度 As平为对照品溶液的吸收度 Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml） W为称样量（mg） 0.8309为校正因子 500为稀释倍数
以氨基葡萄糖 计≥24.0％
高效液相色谱法
反相高效液相色谱法 高效离子交换色谱法 高效凝胶过滤色谱法 RP-HPLC HPIEC HPGFC
Reversed-phase high-performance liquid chromatography
硫酸软骨素的比色法测定：在酸性条件下使样品 水解成氨基己糖，再在碱性条件下与乙酰丙酮和 二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物，该产物在
525 nm处有最大吸收。
具体试验操作：
1、制备对照品溶液－氨基葡萄糖 2、制备供试品溶液－硫酸软骨素 3、反应和测定－缩合反应和比色测定
A Ws 0.8309 500 百分含量（％）＝ 100% As W
致突变、生殖毒性
◆往往需要进行效价（含量）测定
生化药物和基因工程药物质量检 验的基本程序于方法
鉴别试验 杂质检查
安全性检查
效价测定
理化鉴别试验
第 二 节 ： 鉴 别 实 验
化学反应法
对比吸收光谱和特 征吸收的一致性
光谱鉴别法－UV
鉴 别 试 验
色谱鉴别法－HPLC
生物化学鉴别法
对比色谱保 留行为的一 致性
生物制品：是应用普通的生物技术获得
的微生物、细胞及组织等生物材料制备 用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
生化药物和基因工程药物的分类 氨基酸、多肽和蛋白质 生 化 药 物 酶和辅酶类 多糖类 脂质类药物 核酸及其降解产物
基 因 工 程 药 物
激素和神经递质类 胰岛素、生长激素 细胞因子类 人干扰素、人白细胞素、促红细胞生成素
*
总氨基酸含量 (g/100g) 0.44 0.24 0.19 0.60 0.20 0.30 0.27 0.02 0.30 0.06 0.23 0.40 0.15 0.26 0.68 0.11 0.31
游离氨基酸含量 (mg/100g) 1.23 1.25 0.89 7.80 1.07 0.38 0.87 0.09 0.32 1.60 0.32 1.34 0.54 0.39 4.08 1.03 2.09
中药 Traditional Chinese Medicine TCM
生物药物：是指利用生物体、生物组织或
器官等，综合运用生物学、生物化学、免
疫学和药学等原理与方法制得的一类药物。
生化药物 Biochemical drugs 生物合成药物 Biosynthetic drugs 生物制品 Biological products
豚鼠、皮肤过敏和腹腔注射
降压物质检查：检查药物中能够导致血压降低的 物质，如组胺类。
猫或狗
无菌检查：对于不能进行高温灭菌的生物药品，
必须进行无菌检查。
一些特殊污染物的检查：主要考虑外源性DNA、 一些杂蛋白等。 致突变试验：回复突变试验、染色体畸变试验等 生殖毒性试验
来自百度文库
第 四 节 ： 含 量 （ 效 价 ） 测 定
测定法：抑菌试验
常规热源和细菌内毒素的检查
异常毒性试验
安 全 性 检 查
过敏试验 降压物质试验 无菌试验 一些特殊污染物的检查 致突变试验 生殖毒性试验
异常毒性试验：是用一定剂量的药物按照指定的操
作方法和途径给予规定体重的某试验动物，观察其
极性毒性反应。
小鼠、LD50
过敏试验：是对生化药物和基因工程药物中的异性 蛋白进行进检查。
酶及凝血因子类 单克隆抗体、基因药物、反义核酸
生物制品的种类和特点
1、疫苗类药物：细菌疫苗、病毒疫苗、联合疫 苗、多价疫苗
2、抗毒素及抗血清类药物：被动免疫制剂
3、血液制品 4、重组DNA制品：细胞因子、生长因子、酶、抗 体 5、诊断制品 6、其他制品
生化药物和基因工程药物的特点
◆都是来自生物体或通过生物手段获得 ◆分子量都较大 几十KD～几千KD，不是固定值 ◆化学结构式难以确认，单单是光谱分析方法难以进行 ◆在生产过程中需要全面的质量控制 ◆在生产过程中要求进行生物活性检查 ◆ 往往需要进行安全性检查 热源、过敏、异常毒性、
提取法：用适宜的溶剂提取样品中的某成分后挥去溶 剂进行测定的方法。 挥发法：利用被测组分的挥发性，或经过衍生化后将 其转化成挥发性物质来进行测定的方法。 沉淀法：将被测组分转化成沉淀，称定沉淀的重量来 计算含量的方法。
光谱分析方法
比色法
利用样品与显色剂发生现色反应，根据反应产
物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan
生化药物：生化药物是指从动物、植物及 微生物中提取的,或采用生物化学合成和现 代生物技术制得的生命基本物质及其衍生 物、降解产物以及大分子的结构修饰物等， 如氨基酸、多肽、蛋白质等。
生物合成药物：利用现代生物技术研制的一 类药物，包括基因工程药物。 基因工程药物：在确定对某种疾病具有预 防和治疗作用的蛋白质，进而控制该蛋白质 合成过程的基因进行分离、纯化或人工合成， 利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因 导入可以大量生产的受体细胞中，在受体中 不断繁殖和表达，进而生产大规模具有复方 和治疗疾病的蛋白质。