医院细胞遗传室绒毛细胞培养及染色体制备作业指导书

医院细胞遗传室绒毛细胞培养及染色体制备作业指导书
1目的
规范绒毛细胞培养与染色体制备（胶原酶法）过程，为临床绒毛细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。

2测定方法
CO2培养/手工收获
3测定原理
绒毛细胞由受精卵发育分化的滋养层细胞及绒毛间质中的胚外中胚层细胞组成，绒毛细胞与胎儿组织同源，通过绒毛检测，可客观反映胎儿情况。

绒毛既可以直接制片进行染色体的观察，也可以经培养制备染色体，进行产前诊断。

4性能特征
经G显带处理后可见300-550条显带。

5样本类型及受检者准备
在超声引导下，无菌操作吸取孕7-9周孕妇绒毛组织，注入15ml一次性离心管中，立即送检。

6仪器与耗材
酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），无菌离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶，眼科镊，眼科剪，35mm2一次性平皿等。

7试剂
7.1 100ml完全培养基：在超净工作台内，用移液管将培养基和其他各试剂分装入100毫升无菌瓶中（商业培养基或F10培养基70ml，进口胎牛血清30ml，用3.5%碳酸氢钠调节pH 为7.2-7.4）
7.2胶原酶Ⅱ：在超净工作台内，用注射器吸取100mlD-hanks 液于无菌容器中，加入一支胶原酶Ⅱ粉末100mg，充分混匀溶解，终浓度为200U/ml(约为1mg/ml),过滤分装成1ml/管，置-20℃冰箱保存。

7.3秋水仙素浓度：20μg/ml
7.4低渗液：0.075mol/L的KCl溶液
7.5卡诺固定液
7.6 0.25% EDTA-trypsin
7.7双抗：青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml，
7.8 1×PBS或生理盐水
7.9 D-hanks液
8仪器与耗材
酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），无菌离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶，眼科镊，眼科剪，35mm2一次性平皿等。

9操作步骤
9.1标本处理和细胞培养
9.1.1取3个平皿编号1、2、3号，分别加入10ml 1×PBS，再依次加入500U/ml、300U/ml、100U/ml的双抗（含1万u 氨苄青霉素+硫酸链霉素），轻摇混匀。

打开灭菌手术器械盒，用镊子夹取标本至1号平皿中，在1、2、3号三个平皿中依次漂洗并用镊子、剪刀等去掉多余的组织和血块。

在3号平皿中，一手持镊子夹取绒毛，一手持剪刀沿绒毛根部剪下。

9.1.2经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，37℃预温后，在一次性平皿或无菌离心管口用眼科手术剪将绒毛组织剪碎,放入装有20-30倍组织量的胶原酶Ⅱ的离心管中，37℃下消化
10-15min后加含血清培养基终止消化；
9.1.3将离心管中的组织溶液1500rpm离心，去上清，加入含血清完全培养基5ml吹打混匀，37℃ 5%CO2培养箱中行开放式培养。

9.2收获细胞及染色体制片
每天观察，一般3-4天可见上皮样或成纤维样细胞生长。

根据生长情况每隔5-7天换液一次。

一般培养8-10天，待细胞生长旺盛时，按下列程序处理：
9.2.1加入秋水仙素0.04-0.08µg/ml，约4-6小时行细胞学处理；
9.2.2将培养液倒入离心管中，加入PBS或生理盐水2-3毫升，洗净完全培养基，加0.25% EDTA-trypsin约2ml消化
3-5min，含血清培养基终止消化。

置离心管中离心，
1500rpm ，10min；
9.2.3低渗：加入0.075M KCl 4-6ml，吸管吹打，37℃水浴5-10min(或0．4%柠檬酸钠1:1作为低渗液,每管8ml，低渗10min)；
9.2.4预固定：加入1.5ml 3:1（甲醇：冰醋酸）固定液，轻混匀37℃水浴5min，离心,1500rpm，10min；
9.2.4固定：加入3:1（甲醇：冰醋酸）固定液8ml左右，轻混匀，37℃水浴10min；室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml；
9.2.5重复固定：同第6步；
9.2.6离心，1500rpm，10min，去上清；
9.2.7视管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液；
9.2.8滴片：每片1-2滴；
9.2.9烤片：75℃烤箱烘烤3小时。

9.2.10第二天行显带处理。

10参考范围
染色体数目：46,XN，染色体结构：无明显结构异常。

11潜在变异来源
11.1在显微镜下鉴定绒毛枝以及严格无菌操作是培养成功
的关键。

11.2妊娠10周后平滑绒毛膜逐渐退化，仅留下叶状绒毛，
逐渐发育成胎盘，因此孕8周时进行取材，不但取材容易，且利于早期做出产前诊断。

11.3绒毛生长最适宜的pH 为7.4,高于8.0和低于7.0均不适于绒毛细胞生长。

11.4对绒毛检查结果有异常应复查羊水或脐带血。

12环境和安全控制
12.1试剂中含有防腐剂和稳定剂,请勿直接接触皮肤、眼睛、黏膜，一旦接触，立即用大量清水冲洗；受检标本均应假定含有传染性病原菌，其废弃过程应遵循实验室《生物安全管理程序》进行处理；
12.2实验过程中应严格控制环境及实验仪器/设备的温度、湿度等相关条件，以确保实验条件稳定。