第6章工业微生物菌种的扩大培养
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制备中应注意的问题：
1、琼脂的用量 2、不含有沉淀的固体物， 用蒸馏水或去离子水。 3、装量 4、减少冷凝水 5、微量元素先配成一定 的，用移液管定量加入。
（二）米粒孢子（米孢子）
米孢子：霉菌的孢子培养，接种到灭菌后的大米或 小米颗粒上，恒温培养一段时间后所产生的孢子。 优点：⑴保存期较长，可用半年以上。 ⑵孢子量大，107-108个孢子/g米粒。 质量标准： 1.无杂菌污染，每500瓶抽样检查1-2瓶； 2.足够孢子数，发芽率80%； 3.生产能力高； 4.真空干燥后含水率小于8%；
第二节 种子制备的过程
一.种子制备的一般流程 二.孢子的制备 三.种子的制备
一、种子制备的一般流程
斜面 保 存 沙土管 冷干管 液氮管 菌种保存 一级斜面 二级斜面 米孢子 母瓶（摇瓶） 二级种子罐 子瓶（摇瓶） 三级种子罐 实验室种子制备 生产种子制备 一级种子罐
发 酵 罐
确定流程的原则：
3、培养的时间 A、孢子发芽和基质菌丝生长阶段 B、气生菌丝生长阶段 C、孢子形成阶段 D、孢子成熟阶段：显微镜下可看到成串的孢 子，或游离的分散孢子。 E、衰老菌丝自溶阶段：白色斑点、发黑。 4、pH
二、影响种子质量的因素及控制
1、培养基：逐步接近发酵培养基 2、培养条件：温度、溶氧 3、种龄：对数生长期的菌丝
斜放，且摇翻动
（三）种曲
培养材料用麸皮、米糠、稻壳等 柠檬酸、酱油、醋 放线菌孢子的制备：琼脂斜面培养基，碳源和氮源不 要太丰富，干燥和限制营养可诱发孢子形成。培养 温度28 ℃，少数37 ℃；培养时间5-14天。 霉菌孢子的制备：一般采用米孢子或种曲，培养温度 25 ℃-28 ℃，培养时间4-14天。 细菌孢子的制备：琼脂斜面培养基，碳源限量氮源丰 富配方，牛肉膏、蛋白胨。温度37 ℃，少数28 ℃； 培养时间一般1-2天，产芽孢的细菌5-10天。
3、制备过程中注意事项：
⑴营养比斜面要丰富，保持pH稳定 ⑵装量要适当，保持良好的通气；好氧培养三角瓶 40-50mL/250mL、 60~80mL/500mL、 90-110mL/750mL、120-150mL/1000mL。 厌氧培养时装液量增加一倍。 ⑶灭菌时要注意棉塞不要被打湿。 ⑷摇床转速。 ⑸注意摇床上下、边缘、中心的温差。
第六章 工业种子的扩大培养
讲授内容：
第一节 概述 第二节 种子制备的过程 第三节 种子质量的控制
【教学目的与要求】了解种子制备过程中的相 关术语、掌握各种种子制备的方法及影响种 子质量的因素和控制。 【教学重点与难点】种子制备的方法及影响种 子质量的因素和控制。
思考题：
1、简述种子制备的工艺流程 2、怎样确定种子罐的级数？ 3、作为种子应具备那些条件？ 4、简述影响种子质量的因素及控制。 5、概念：接种量、种子制备、种子罐的级数、发 酵罐的级数、种龄、孢子制备。 6、种子异常情况分析。
第一节 概述
定义：由保藏的菌种开始，经过逐级 扩大培养后，最后获得供生产车间生产的， 足够数量和优质质量的纯种。纯种培养物 称为种子。种子的扩大培养过程又称种子 制备。
菌种扩大培养的目的： 1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种； 目的就是：a、缩短发酵周期，降低能耗、减少 染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的） b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑 制杂菌的生长。 2.让菌种从固试管、液体试管……，逐步适应； 如：啤酒酵母 3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减 少“倒罐”现象。
三、种子的制备 （一）摇瓶种子制备 （二）种子罐的种子培养 种子制备:将固体培养的孢子或菌丝转到液 体培养基中培养，使其产生大量的菌丝或菌 体的过程。
（一）摇瓶种子制备
1、摇瓶种子： 将斜面种子、米孢子、种曲接种于锥形 瓶内液体培养基中，摇床上震荡培养得到的 液体种子。 2、制备流程 培养基配制→分装→灭菌冷却→接种→ 震荡培养→摇瓶种子。
2、制备过程注意事项：
第三节 种子质量的控制
一、影响孢子质量的因素及控制
1、培养基 原材料产地、品种、加工方法如：蛋白胨、琼 脂；水质等 2、培养的温度和湿度 龟裂链霉菌（土霉素）36.5-37℃ 36.5 ℃3天+28.5 ℃1天，产量比36.5 ℃4天 高3-7倍 湿度40-45%(北方)，35-42%(南方)。
1、保证发酵罐的菌种量； 2、尽量缩短流程、以防治染菌。
考虑因素：
1、发酵罐的体积 2、菌种的特性 3、工艺上菌种量的要求
扩大培养的方法
通常有两种方法： 固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于 酿造业， 有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大 曲 液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业
液体培养为主导方式。
作为种子必备的条件： 1.生命旺盛有活力，移种后，能迅速生长，缩 短延滞期。 2.菌体总量适宜，保证发酵罐的接种量。 3.遗传表现性要稳定； 4.菌种要纯。无杂菌污染。 5. 保持稳定的生产能力。
概念：
种子罐的级数：种子在种子罐中扩大培养的次数。
发酵罐的级数：种子罐数加一。
接种量：是指移入的种子液体体积和接种后培养液体 积的比例。 或移入的种子液体积占接种前培养液体积的百分数。 种龄：生产种子时的培养时间。 孢子制备：用固体培养的种子叫孢子制备。 种子制备：用液体培养的种子叫种子制备。
随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微 生物工业的菌种已形成了产业化。例如：酒精的 生产 原生产工艺流程为：…… 以酵母为线条的生产工艺为： 以霉菌为线条的生产工艺为： 现在：（1）酵母使用粉末酵母 鲜压榨酵母 固定化酵母细胞 （2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代
二、固体培养孢子制备
（一）斜面孢子的制备 （二）米粒孢子 （三）种曲
种子进入发酵罐：能迅 速生长，达到一定的量， 利于产物合成。
三 级 种 子 罐
发 四 酵 级 罐 发 酵
1、生产流程：
培养基配制→灭菌（培养基及种子罐） → 冷却 →接种→一级培养→二级培养→接入发酵罐
①培养基要求与发酵培养基相同 ②接种方式：a、火圈保护法 b、压差法 ③接种时通入的空气温度要适中 ④pH要合理 ⑤控制合适的接种量
wk.baidu.com
三、种子质量的标准
1、细胞或菌丝：单细胞菌体菌体健壮、菌形一致， 均匀整齐，还要有一定的排列和形态。霉菌和放 线菌菌丝粗壮，分枝情况、内含物情况良好。 2、生化指标：N、C、pH的变化 3、产物生成量： 4、酶活力 5、确定种子液无任何杂菌
四、种子异常的分析
1、菌种生长发育缓慢或过快 通入的空气温度低、灭菌质量差。 2、菌丝结团：接种量、搅拌不好。 3、菌丝粘壁：搅拌不好、泡沫多、装料少。
4、质量检查
⑴菌体浓度：外观稠度、静止沉降率、离心沉 降率。 ⑵菌丝的生长阶段：对数期后期。 ⑶代谢情况： ⑷生产能力：摇瓶发酵实验。
（二）种子罐的种子培养
孢 子 或 摇 瓶 菌 丝 一 级 种 子 罐 二 级 种 子 罐 发 二 酵 级 罐 发 酵 发 三 酵 级 罐 发 酵
种子罐级数的确定： 1、菌种的体积 2、孢子发芽能力 3、发酵罐的体积
细菌 霉菌 放线菌
7-24h 16-50h 21-64h. 4、接种量；霉菌的发酵10%；抗生素7-15%；
制霉菌素0.1-1%好于10%。
5.pH值 菌种扩大培养的pH值很重要，影响到菌 体的正常生长，需要注意以下两点： （1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往 往与发酵最适pH值不同。 （2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5~1.0个 单位，因此，……（三角瓶灭菌后，不能够调整 pH值，不宜无菌操作）
（一）斜面孢子的制备
在试管或扁瓶（茄子瓶）内，以琼脂固化的培 养基表面生长的菌种培养物。
斜面种子制备流程： 培养基 →分装→ 灭菌→冷却→ 摆斜面→接种→培养→斜面种子 影响斜面种子质量的因素： 1、原材料的质量；2、灭菌条件； 3、接种量；4、培养条件；5、培 养时间；6、有害气体和挥发物；7、 冷藏时间。
制 备 工 艺 流 程
：
大米或小米 ↓ 水洗浸泡 ↓ 沥干 ↓ 分装 ↓ 混匀 ↓ 灭菌 ↓ 接种 （摇匀） ↓ 培养 ↓ 米孢子
注意事项：
无菌蒸馏水 ↓ 斜面孢子 ↓ 孢子悬浮液
1、浸泡时间及加营养液 的量应掌握在灭菌后米 粒熟透而不粘连。 2、分装量2-3厘米厚度 3、米粒不要碰在瓶口 4、前期摇动，后期不要 再动 5、米粒可存放半年，冰 箱4℃、真空干燥蜡封。
1、琼脂的用量 2、不含有沉淀的固体物， 用蒸馏水或去离子水。 3、装量 4、减少冷凝水 5、微量元素先配成一定 的，用移液管定量加入。
（二）米粒孢子（米孢子）
米孢子：霉菌的孢子培养，接种到灭菌后的大米或 小米颗粒上，恒温培养一段时间后所产生的孢子。 优点：⑴保存期较长，可用半年以上。 ⑵孢子量大，107-108个孢子/g米粒。 质量标准： 1.无杂菌污染，每500瓶抽样检查1-2瓶； 2.足够孢子数，发芽率80%； 3.生产能力高； 4.真空干燥后含水率小于8%；
第二节 种子制备的过程
一.种子制备的一般流程 二.孢子的制备 三.种子的制备
一、种子制备的一般流程
斜面 保 存 沙土管 冷干管 液氮管 菌种保存 一级斜面 二级斜面 米孢子 母瓶（摇瓶） 二级种子罐 子瓶（摇瓶） 三级种子罐 实验室种子制备 生产种子制备 一级种子罐
发 酵 罐
确定流程的原则：
3、培养的时间 A、孢子发芽和基质菌丝生长阶段 B、气生菌丝生长阶段 C、孢子形成阶段 D、孢子成熟阶段：显微镜下可看到成串的孢 子，或游离的分散孢子。 E、衰老菌丝自溶阶段：白色斑点、发黑。 4、pH
二、影响种子质量的因素及控制
1、培养基：逐步接近发酵培养基 2、培养条件：温度、溶氧 3、种龄：对数生长期的菌丝
斜放，且摇翻动
（三）种曲
培养材料用麸皮、米糠、稻壳等 柠檬酸、酱油、醋 放线菌孢子的制备：琼脂斜面培养基，碳源和氮源不 要太丰富，干燥和限制营养可诱发孢子形成。培养 温度28 ℃，少数37 ℃；培养时间5-14天。 霉菌孢子的制备：一般采用米孢子或种曲，培养温度 25 ℃-28 ℃，培养时间4-14天。 细菌孢子的制备：琼脂斜面培养基，碳源限量氮源丰 富配方，牛肉膏、蛋白胨。温度37 ℃，少数28 ℃； 培养时间一般1-2天，产芽孢的细菌5-10天。
3、制备过程中注意事项：
⑴营养比斜面要丰富，保持pH稳定 ⑵装量要适当，保持良好的通气；好氧培养三角瓶 40-50mL/250mL、 60~80mL/500mL、 90-110mL/750mL、120-150mL/1000mL。 厌氧培养时装液量增加一倍。 ⑶灭菌时要注意棉塞不要被打湿。 ⑷摇床转速。 ⑸注意摇床上下、边缘、中心的温差。
第六章 工业种子的扩大培养
讲授内容：
第一节 概述 第二节 种子制备的过程 第三节 种子质量的控制
【教学目的与要求】了解种子制备过程中的相 关术语、掌握各种种子制备的方法及影响种 子质量的因素和控制。 【教学重点与难点】种子制备的方法及影响种 子质量的因素和控制。
思考题：
1、简述种子制备的工艺流程 2、怎样确定种子罐的级数？ 3、作为种子应具备那些条件？ 4、简述影响种子质量的因素及控制。 5、概念：接种量、种子制备、种子罐的级数、发 酵罐的级数、种龄、孢子制备。 6、种子异常情况分析。
第一节 概述
定义：由保藏的菌种开始，经过逐级 扩大培养后，最后获得供生产车间生产的， 足够数量和优质质量的纯种。纯种培养物 称为种子。种子的扩大培养过程又称种子 制备。
菌种扩大培养的目的： 1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种； 目的就是：a、缩短发酵周期，降低能耗、减少 染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的） b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑 制杂菌的生长。 2.让菌种从固试管、液体试管……，逐步适应； 如：啤酒酵母 3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减 少“倒罐”现象。
三、种子的制备 （一）摇瓶种子制备 （二）种子罐的种子培养 种子制备:将固体培养的孢子或菌丝转到液 体培养基中培养，使其产生大量的菌丝或菌 体的过程。
（一）摇瓶种子制备
1、摇瓶种子： 将斜面种子、米孢子、种曲接种于锥形 瓶内液体培养基中，摇床上震荡培养得到的 液体种子。 2、制备流程 培养基配制→分装→灭菌冷却→接种→ 震荡培养→摇瓶种子。
2、制备过程注意事项：
第三节 种子质量的控制
一、影响孢子质量的因素及控制
1、培养基 原材料产地、品种、加工方法如：蛋白胨、琼 脂；水质等 2、培养的温度和湿度 龟裂链霉菌（土霉素）36.5-37℃ 36.5 ℃3天+28.5 ℃1天，产量比36.5 ℃4天 高3-7倍 湿度40-45%(北方)，35-42%(南方)。
1、保证发酵罐的菌种量； 2、尽量缩短流程、以防治染菌。
考虑因素：
1、发酵罐的体积 2、菌种的特性 3、工艺上菌种量的要求
扩大培养的方法
通常有两种方法： 固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于 酿造业， 有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大 曲 液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业
液体培养为主导方式。
作为种子必备的条件： 1.生命旺盛有活力，移种后，能迅速生长，缩 短延滞期。 2.菌体总量适宜，保证发酵罐的接种量。 3.遗传表现性要稳定； 4.菌种要纯。无杂菌污染。 5. 保持稳定的生产能力。
概念：
种子罐的级数：种子在种子罐中扩大培养的次数。
发酵罐的级数：种子罐数加一。
接种量：是指移入的种子液体体积和接种后培养液体 积的比例。 或移入的种子液体积占接种前培养液体积的百分数。 种龄：生产种子时的培养时间。 孢子制备：用固体培养的种子叫孢子制备。 种子制备：用液体培养的种子叫种子制备。
随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微 生物工业的菌种已形成了产业化。例如：酒精的 生产 原生产工艺流程为：…… 以酵母为线条的生产工艺为： 以霉菌为线条的生产工艺为： 现在：（1）酵母使用粉末酵母 鲜压榨酵母 固定化酵母细胞 （2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代
二、固体培养孢子制备
（一）斜面孢子的制备 （二）米粒孢子 （三）种曲
种子进入发酵罐：能迅 速生长，达到一定的量， 利于产物合成。
三 级 种 子 罐
发 四 酵 级 罐 发 酵
1、生产流程：
培养基配制→灭菌（培养基及种子罐） → 冷却 →接种→一级培养→二级培养→接入发酵罐
①培养基要求与发酵培养基相同 ②接种方式：a、火圈保护法 b、压差法 ③接种时通入的空气温度要适中 ④pH要合理 ⑤控制合适的接种量
wk.baidu.com
三、种子质量的标准
1、细胞或菌丝：单细胞菌体菌体健壮、菌形一致， 均匀整齐，还要有一定的排列和形态。霉菌和放 线菌菌丝粗壮，分枝情况、内含物情况良好。 2、生化指标：N、C、pH的变化 3、产物生成量： 4、酶活力 5、确定种子液无任何杂菌
四、种子异常的分析
1、菌种生长发育缓慢或过快 通入的空气温度低、灭菌质量差。 2、菌丝结团：接种量、搅拌不好。 3、菌丝粘壁：搅拌不好、泡沫多、装料少。
4、质量检查
⑴菌体浓度：外观稠度、静止沉降率、离心沉 降率。 ⑵菌丝的生长阶段：对数期后期。 ⑶代谢情况： ⑷生产能力：摇瓶发酵实验。
（二）种子罐的种子培养
孢 子 或 摇 瓶 菌 丝 一 级 种 子 罐 二 级 种 子 罐 发 二 酵 级 罐 发 酵 发 三 酵 级 罐 发 酵
种子罐级数的确定： 1、菌种的体积 2、孢子发芽能力 3、发酵罐的体积
细菌 霉菌 放线菌
7-24h 16-50h 21-64h. 4、接种量；霉菌的发酵10%；抗生素7-15%；
制霉菌素0.1-1%好于10%。
5.pH值 菌种扩大培养的pH值很重要，影响到菌 体的正常生长，需要注意以下两点： （1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往 往与发酵最适pH值不同。 （2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5~1.0个 单位，因此，……（三角瓶灭菌后，不能够调整 pH值，不宜无菌操作）
（一）斜面孢子的制备
在试管或扁瓶（茄子瓶）内，以琼脂固化的培 养基表面生长的菌种培养物。
斜面种子制备流程： 培养基 →分装→ 灭菌→冷却→ 摆斜面→接种→培养→斜面种子 影响斜面种子质量的因素： 1、原材料的质量；2、灭菌条件； 3、接种量；4、培养条件；5、培 养时间；6、有害气体和挥发物；7、 冷藏时间。
制 备 工 艺 流 程
：
大米或小米 ↓ 水洗浸泡 ↓ 沥干 ↓ 分装 ↓ 混匀 ↓ 灭菌 ↓ 接种 （摇匀） ↓ 培养 ↓ 米孢子
注意事项：
无菌蒸馏水 ↓ 斜面孢子 ↓ 孢子悬浮液
1、浸泡时间及加营养液 的量应掌握在灭菌后米 粒熟透而不粘连。 2、分装量2-3厘米厚度 3、米粒不要碰在瓶口 4、前期摇动，后期不要 再动 5、米粒可存放半年，冰 箱4℃、真空干燥蜡封。