生物工程第3章 蛋白质工程-第1讲

✓系统性分类
20世纪70年代，建立了蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB），PDB数据库最初由美国 Brookhaven国家实验室负责维护和管理，为适应结 构基因组和生物信息学研究的需要，1998年，由美 国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助， 成立了结构生物学合作研究协会(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics，RCSB)， 并由RCSB对PDB进行维护和管理。
✓通过分析蛋白质的一级结构、空间结构和功能之 间相互关系，找出关键的基团和结构*；
✓围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改 造的方案，并用基因工程的方法去实施；
✓对经过改造的蛋白质进行功能测定，看看改造的 效果如何；
✓重复上述带*的两步，直到获得比较理想的结果； ✓分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。
4 重叠pcr应用
构建融合基因 构建突变基因 A、在重叠延伸PCR 中，两个重叠的DNA 片段是分别从两个独
立的PCR 扩增反应得到的。预设突变构建在重叠区域，存在 于两个扩增片段中。
B、设计4 种引物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游 序列的DNA 片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及其下 游序列的DNA 片段，两个侧翼引物含野生型序列，两个突变 引物含有希望引进的突变位点，如置换插入或缺失。
C、混合两次PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠 片段之间退火，延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次 PCR，即可得到目标突变体。
5 注意事项 保证阅读框正确
使用高保证酶 phusion pfuDNA聚 合酶
蛋白质工程
第一讲 蛋白质工程概况
一、蛋白质工程的含义 （***）
➢1983年由Ulmer首先提出 “蛋白质工程”的概念， 是生物工程的重要组成部分。
(2) 此技术可以将任意的两个目的基因拼接连接形 成2个目的基因的融合基因,中间无任何非目的基因 的DNA序列,这样就避免因加入连接序列可能出现 的非目的基因序列,从而在体外就可得到高质量的 目的基因序列.
3 引物的设计
采用一段已知的500～600bp碱基的DNA片段为 PCR模板,根据所要合成的DNA序列可以设计一系 列的PCR嵌合引物对,长度为50～60bp,且从5′到3′ 方向顺序重叠,重叠碱基数目为25～30bp,通过多 重PCR全部引物叠加所得到的DNA正是自己所要 合成的长片段DNA.
➢蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密 不可分。蛋白质分子的构象是其功能活性的基础， 是决定这种特殊生物功能的关键因素。（***） ➢蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、四 级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结 构均属于空间结构。
蛋白质的结构层次
四级结构 三级结构 结构域 超二级结构 二级结构 一级结构
生物功能
➢二级结构：蛋白质主链折叠产生的有规则构象， 主要有-螺旋、-折叠片、-转角和无规卷曲等。 结构复杂的蛋白质分子就由 （***） 这些比较简单的二级结构元件 进一步组合而成。
➢超二级结构（super-secondary struture， 结构模体 struture motif ）：相邻的二 级结构元件组合在一起，彼此相互作 用，形成有规则的在空间上能辨认的 二级结构组合或二级结构串，其充当 三级结构的构件。 （***）
三、蛋白质工程的原理
中心法则
➢蛋白质工程的理论依据：基因指导蛋白质的合成。（**）
基因DNA
转录
翻译
mRNA
多肽链
折叠
生物功能
三维结构的蛋白质
预期蛋白 质的功能
设计预期蛋白 质的三维结构
蛋白质工程：反向生物学
分子设计
基因DNA
DNA合成 推测多肽链的 氨基酸序列
➢蛋白质工程设计原理 蛋白质工程设计（蛋白质分子设计）：在知道需要 改造的蛋白质的结构和功能的基础上，通过理论的 方法，提出蛋白质改造的设计方案。为蛋白质工程 提供指导性信息，也为探索蛋白质的折叠机制提供 重要方法。
➢特征：在基因水平上特异地构建一个非天然的优 良工程蛋白。
➢实质：对编码蛋白质的基因进行改造。
➢前提：了解蛋白质的结构、功能及理化性质等
➢原理：基因修饰或基因合成
设计理念
分子理 性设计
以蛋白质的性质、结构和功 能的信息及其相互关系为基 础，包括活性设计、专一性 设计、构象设计等
分子定 以体外模拟自然进化为 向进化 基础，基因修饰和改造
重叠延伸PCR
1 原理
重叠延伸PCR 技术由于使用了具有互补末端的引 物，使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩 增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩 增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个DNA 片段连在一起，用于嵌合基因的构建；
2 重叠延伸PCR的特点
(1) 不需要内切酶消化和连接酶处理,利用PCR技术 在体外进行有效的基因重组和定点突变,操作非常 简便,可以利用这一技术很快获得利用内切酶消化 的方法难以得到的产物,可用于大片段基因的人工 合成,且成功率非常高
✓ 一级结构规定了亚基间的结 合方式，四级结构的形成遵 从“自我装配”的原则。
血红蛋白的四级结构
由两个α亚基和两个 β亚基构成一个四面 体构型，每个亚基分 别含1个血红素辅基。
二、蛋白质结构分类
➢复杂性和多样性是蛋白质结构的重要特征，（超） 二级结构的组合构成了大多数结构域结构的核心。
➢在结构域中，结构模体的组织方式是有限的，而且 一些组合具有明显的优势，常常出现在功能和序列都 不相同的蛋白质中，使蛋白质的结构域表现出一些主 要的类型。
➢蛋白质工程研究的4大主要类型
✓利用已源自文库蛋白质的一级结构信息开展应用研发；
✓定量确定蛋白质结构-功能关系：这是目前蛋白质工 程研究的主体，包括蛋白质三维结构模型的建立，酶 催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等；
✓从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋 白质；
✓根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成 它及其变异体。
➢1984年，Perry通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)， 并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶 热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应 用价值。
➢1987年，福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面 的Asp99和Glu156改成Lys，而导致了活性中心 His64质子pKa从7下降到6，使酶在pH6时的活力提 高10倍。
➢蛋白质工程：以蛋白质分子的结构与功能的关系 研究为基础，利用基因工程技术，按照人类自身的 需要，定向改造天然蛋白质，甚至创造新的、自然 界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子的现代 生物技术。即：按照特定的需要，对蛋白质进行分 子设计和改造，并表达出具有不同功能的蛋白质。
✓通过改造与蛋白质相对应的基因中的碱基顺序， 或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通 过基因表达获得具有新的特性的蛋白质技术。这是 一门从改变基因入手，定做新蛋白质的技术 ，是在 基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。
基因水平的改造：改造蛋白质的编码基因 分子设计
的层次 蛋白质水平的改造：蛋白质的加工与修饰
四、蛋白质工程的程序与操作方法 （**）
➢蛋白质工程的程序 ✓从生物体中分离纯化目的蛋白； ✓测定其氨基酸序列； ✓借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能多 地了解其空间结构信息；
✓对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能 域*；
➢1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段 反平行α-螺旋组成含73个氨基酸残基的成果。这显 示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋 白的目标已是可望又可及了。
➢由此蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造 符合人类需要的蛋白质的新时期。
第二讲 蛋白质的结构基础
一、蛋白质的结构层次
➢蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的、 具有特定分子结构的高分子化合物。
➢蛋白质工程的操作方法 ✓合理化的分子设计 ✓基因的定向突变和定向进化 ✓突变体的大规模筛选 ✓突变体的表达及其分析检测
五、蛋白质工程的技术策略 （**）
➢通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效； ➢通过改变蛋白质的组成和空间结构，提高其在特 定(极端)条件下的稳定性；
➢通过改变蛋白质的遗传信息，提高其独立工作能 力，不再需要辅助因子；
蛋白质结构分类是蛋白质结构研究的一个重要方向， 包括如折叠类型、拓扑结构、家族、超家族、结构 域、二级结构、超二级结构等不同层次。
蛋白质结构分类数据库是三维结构数据库（PDB） 的重要组成部分。
蛋白质结构分类数据库SCOP（Structural Classification Of Proteins）：由英国医学研究委员会 （Medical Research Council，MRC）的分子生物学 实验室和蛋白质工程研究中心开发和维护。该数据 库对已知三维结构的蛋白质进行分类，并描述了它 们之间的结构和进化关系。
αα（复绕α-螺旋）
常见的 超二级结构
βαβ ββ（β曲折和希腊钥匙拓扑结构） β-折叠桶
α-螺旋-β转角-α-螺旋
➢结构域（domain）：多肽链在二 （***） 级结构及超二级结构的基础上，进 一步卷曲折叠成的相对独立的紧密 球状结构，即它们按一定的拓扑学 规则构成的三维空间结构实体。
✓ 通常是几个(超)二级结构的组合；
溶菌酶分子的三级结构
✓三级结构是蛋白质发挥生物活性所必须的；
✓球状蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从 球状蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及 非极性基团间的相互作用成为可能。
➢蛋白质的四级结构：专指亚 基的种类、数量以及各个亚 基在寡聚蛋白质中的空间排 布和亚基间的相互作用。
✓ 亚基单独存在时无生物活性 或活性很低，只有相互聚合 成特定构象时才具有完整的 生物活性；
✓通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究， 获取有关蛋白质理化、结构、功能等各方面的信息， 在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码 序列进行有目的设计改造，获取自然界没有的、具 有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的 过程，是包含多学科的综合科技工程。
➢目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋 白质的结构进行分子设计与改造，定向改造或创造 蛋白质。
随机突变库的构建（快速、简 实施的 便、高效） 必要条件
筛选系统（灵敏、准确、高通量）
二、蛋白质工程的主要研究内容 （***）
➢根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋 白质；
➢从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能， 设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。
➢确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的 关系（核心）；
组成；作为酶活性部位的功能域常由多个结构域的
相邻部分组成，结构域的剩余部分不参与组成活性
部位。
反平行螺旋结构域
结构域 的类型
混合型折叠结构域（结构域） 反平行折叠片结构域
富含金属或二硫键结构域
➢蛋白质的三级结构：蛋白 质分子在二级结构或超二级 结构基础上进一步盘曲折叠 而形成的整体构象，即一条 多肽链全部原子在三维空间 的排布位置。
✓ 结构域自身是紧密装配的，但结构域与结构域之间 关系松懈；
✓ 对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同， 即这些蛋白为单结构域蛋白；较大的蛋白质分子或 亚基往往由两个以上结构域缔合而成三级结构；
✓ 结构域是球状蛋白质的折叠单位。
✓ 结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白
质的功能域，但不总是；功能域通常由多个结构域
➢蛋白质的一级结构（氨基酸序列）决定它的高 级结构，是阐明蛋白质生物功能的分子基础。（***）
IAYKPAG 。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。 。 。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。 。。。
氨基酸序列（一级结构） 高级结构
➢通过改变蛋白质的特性，使其便于分离纯化； ➢通过改变蛋白质的调控位点，使其与抑制剂脱离， 解除反馈抑制作用。
六、蛋白质工程的诞生与发展
➢蛋白质工程是20世纪80年代初诞生的一个新兴生 物技术领域。
➢1983年，Ulmer在“Science”上发表以“Protein Engineering” (蛋白质工程)为题的专论，一般将此视 为蛋白质工程诞生的标志。