淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒国家参考品的制备_王春娥
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1 材料与方法
1． 1 菌株 NG 菌株（ CMCC 29105、29106、29400、 29403、29805、29806、29807、29808、29816、29818 ） ， 非 NG 菌株［铜绿假单胞菌株（ CMCC 10104） 、金黄 色 葡 萄 球 菌 株 （ CMCC 26001 ） 、脑 膜 炎 奈 瑟 菌 株 （ CMCC 29018 ） 、脑膜炎奈瑟菌株 （ CMCC 29204 ） 、 干酪乳杆菌株（ CMCC 34103） 、大肠埃希菌株（ CMCC 44103） 、变形杆菌株 （ CMCC 49102 ） 、伤寒沙门 菌 株 （ CMCC 50096 ） 、福 氏 志 贺 氏 菌 株 （ CMCC 51573） 、白色念珠菌株（ CMCC 98001） ］均来源于中 国医学细菌保藏管理中心。 1． 2 主要试剂及仪器 （ PCＲ-荧光探针法） NG 核 酸检测试剂盒 A 和 NG 核酸检测试剂盒 B 均为中山 大学达安基因股份有限公司产品； NG 核酸检测试剂 盒 C 为上海科华生物工程股份有限公司产品； NG 核 酸检测试剂盒 D 为上海之江生物科技股份有限公司 产品； 沙眼衣原体 / NG 核酸检测试剂盒 E（ 多重实时 荧光 PCＲ 法） 为 Cepheid AB 公司产品。注射用生理 盐水、GC 基础培养基、血红蛋白粉、Vitox Supplement 均购自 Oxoid 公司； 普通营养琼脂、MＲS 培养基均购 自 BD 公司。显微镜（ OLYMPUS BX51） 、细菌计数板 （ THOMA HELBEＲ） 、标准细菌比浊管均由中国食品 药品检定研究院提供； 荧光定量 PCＲ 仪（ ABI7500） 购 自 ABI 公司； 全自动医用 PCＲ 分析系统（ GeneXpert Dx） 购自 Cepheid AB 公司。 1． 3 菌株的培养 选择适宜的培养基将菌株进行 复苏、传代培养。将 NG 菌株接种至 GC 培养基上， 于 37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培养 18 h，刮取新鲜培养 物进行形态 学、生 理 生 化 特 性 鉴 定，并 提 取 基 因 组 DNA 进行分子生物学特征分析； 将脑膜炎奈瑟菌接 种至巧克力色琼脂培养基上，于 37 ℃ 、5% CO2 培养 箱中培养 18 h，刮取新鲜培养物进行形态学、生理生 化特性鉴定； 干酪乳杆菌接种至 MＲS 培养基，于 37 ℃ 培养箱中过夜培养； 白色念珠菌接种至改良马丁 培养基，于 25 ℃ 培养箱中过夜培养； 其余菌株分别
参考品，然后利用 5 种不同来源的 NG 核酸检测试剂盒验证各种参考品，并考察参考品在不同处理条件下的稳定
性。结果 每株菌在各自适宜的培养基和温度下培养后，均生长良好，无杂菌污染。经 5 种试剂盒验证检测，10 份
阳性参考品的检测结果均为阳性，10 份阴性参考品的检测结果均为阴性，精密性参考品检测结果为 Ct 值的 CV 均
微生物学免疫学进展 2016 年 10 月第 44 卷第 5 期 Prog in Microbiol Immunol，Oct． 2016，Vol． 44 No． 5
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淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒国家参考品的制备
王春娥，卢旭，刘茹凤，石继春，李红，陈琼，唐静，陈翠萍，叶强
中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050
摘要： 目的 制备淋病奈瑟菌（ Neisseria gonorrhoeae，NG） 核酸检测试剂盒国家参考品。方法 分别将 10 株 NG 和
10 株非 NG 参考菌株在各自适宜的培养基和温度下培养，收获新鲜无污染培养物，用比浊法和显微计数法将不同
的培养物制备成 10 份 NG 菌悬液阳性参考品、5 份精密性参考品和 10 份非 NG 菌悬液阴性参考品以及最低检出限
基金项目： 国家科技基础条件平台国家微生物资源平台奖补经费资 助项目（ NIMＲ 2015-2）
作者简介： 王春娥（ 1980－） ，女，助理研究员，主要从事医学微生物菌 种资源的收集、保藏及相关科研。
通讯作者： 叶强，主任技师，E-mail： qiangyee@ nifdc． org． cn
淋病奈瑟菌（ Neisseria gonorrhoeae，NG） 属革兰 阴性球菌，为严格的人体寄生菌。NG 可引起人类 泌尿生殖系统化脓性感染（ 俗称淋病） ，淋病是中国 发病率较高的性传播疾病之一，早期发现和有效治
接种至营养琼脂培养基，于 37 ℃ 培养箱中过夜培 养。 1． 4 参考品原菌液的定值 1． 4． 1 阳性、阴性及精密度参考品原菌液的定值
除干酪乳杆菌采用活菌计数法外，其余参考品的 定值采用比浊法。分别选取生长良好且无污染的菌 种，用一次性接种环刮取新鲜培养物至灭菌生理盐 水中，制备菌悬液，采用标准细菌比浊管比浊后，用 灭菌生理盐水稀释至 1 ×108 / mL，灭活后分装，于 － 20 ℃ 以下保存。干酪乳杆菌菌悬液用灭菌生理盐 水稀释至约 1 ×108 / mL 后，10 倍系列稀释至 10－6 数 量级，取 10－4 、10－5 、10－6 数量级菌悬液涂布平皿，进 行活菌计数。根据计数结果稀释至 1×108 / mL，灭活 后分装，于－20 ℃ 以下保存。 1． 4． 2 最低检出限参考品原菌液的定值 采用显 微计数法和活菌计数法。用一次性接种环刮取 NG （ CMCC 29818） 新鲜培养物至灭菌生理盐水中，制 备菌悬液。菌悬液用标准细菌比浊管进行比浊后， 参考比浊浓度取 样 进 行 显 微 计 数［16］。 同 时 进 行 活 菌计数： 将菌悬液用灭菌生理盐水稀释至约 108 / mL 后，10 倍系列稀释至 10－6 数量级，取 10－4 、10－5 、10－6 数量级菌悬液涂布平皿，37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培 养后计数。根据计数结果稀释至 1×107 / mL，灭活后 分装，于－20 ℃ 以下保存。 1． 5 参考品的制备 1． 5． 1 阳性参考品 分别将 10 株 NG 原菌液稀释 至 106 / mL，定量分装，0． 5 mL / 管，于－20 ℃ 以下保 存，即 NG-P1 ～ NG-P10。 1． 5． 2 阴性参考品 分别将 10 株阴性参考品菌株 的原菌液稀释至 106 / mL，定量分装，0． 5 mL / 管，于－ 20 ℃ 以下保存，即 NG-N1 ～ NG-N10。 1． 5． 3 精 密 性 参 考 品 将 NG 原 菌 液 （ CMCC 29818） 稀释至 106 / mL，定量分装，1． 0 mL / 管，于 － 20 ℃ 以下保存，即 NG-Ｒ，5 份 / 套。 1． 5． 4 最低检出限参考品 将最低检出限参考品 菌株原菌液（ CMCC 29818） 稀释至 105 / mL，定量分 装，0． 5 mL / 管，于－20 ℃ 以下保存，即 NG-S。 1． 6 分装均匀度 随机抽取阳性参考品、最低检出 限参考品各 5 支，精密性参考品 14 支，用试剂盒 E 进行检测，计算 Ct 值的 CV 值。 1． 7 参考品的验证 按照试剂盒 A ～ E 的说明书 方法检测参考品，并对其进行验证。 1． 7． 1 准确性 检测 10 份阳性参考品，要求均为 阳性。
小于 5． 0% ； 5 种试剂盒的最低检出限均能达到 1 000 / mL，其中试剂盒 B 和 E 的最低检出限达 100 / mL。参考品在 2
～ 8 ℃ 放置 7 d、3 7 ℃ 放置 3 d 的热稳定性及反复冻融 5 次以内的稳定性良好。结论 制备的 NG 核酸检测试剂盒
国家参考品的准确性、特异性及精密性均符合要求，可用于 NG 核酸检测试剂盒的质量评价。
Abstract： Objective To prepare the national reference for the detection kit of neisseria gonorrhoeae nucleic acid． Method s Allof 10 strains of neisseria gonorrhoeae and 10 strains of non-neisseria gonorrhoeae were cultured in a suitable media and temperature，then fresh and uncontaminated cultures were collected． The preparation of references was carried out in bacterial susponsion of both 10 positive reference of neisseria gonorrhoeae and 10 negtive reference of non-neisseria gonorrhoeae，bacterial susponsion of 5 precision reference，and a bacterial susponsion of minimal detection limit reference by turbidimetry and microscopic counting． The references were verified by five PCＲ detection kits for neisseria gonorrhoeae from different companies，and evaluated by stability test under various conditions． Ｒesults Each from all strains grew well in its own suitable media and temperature，and the cultures were not contaminated． The detections showed correct results for 10 positive and 10 negative references，respectively，and the CV were all less than 5． 0% for tested results of precision by verification of the five PCＲ detection kits． A bacterial concentration of 1 000 / mL was determined by the five kits，and a concentration of 100 / mL determined by the kit No． B and E． The stability tests showed good results on the references after stored at 2－8 ℃ for 7 days，or 37 ℃ for 3 days，or 5 cycles of freezing-thawing，respectively． Conclusion The accuracy， specificity，reproducibility can met the relevant requirements for the prepared national references，which could be used in evaluation of quality control of PCＲ detection kit for neisseria gonorrhoeae nucleic acid． Key words： Neisseria gonorrhoeae； Nucleic acid； Kit； Ｒeference
关键词： 淋病奈瑟菌； 核酸； 试剂盒； 参考品
中图分类号： Ｒ392-33
源自文库
文献标志码： A
文章编号： 1005-5673（ 2016） 05-0021-05
DOI： 10． 13309 / j． cnki． pmi． 2016． 05． 004
Preparation of national reference for detection kit of neisseria gonorrhoeae nucleic acid
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微生物学免疫学进展 2016 年 10 月第 44 卷第 5 期 Prog in Microbiol Immunol，Oct． 2016，Vol． 44 No． 5
疗是控制 NG 感染的有效措施［1－2］。NG 核酸检测 以其快速、灵敏成为诊断 NG 感染的主流方法［3－5］， 目前国内 NG 核酸检测试剂盒已有 10 多家企业被 批准上市，国家参考品是科学、公正评价体外诊断试 剂质量的重 要 物 质 和 依 据，根 据《体 外 诊 断 试 剂 注 册管理办法》相关规定［6－7］，为评价和控制 NG 核酸 检测试剂盒质量，实验制备了 NG 核酸检测试剂盒 国家参考品，并对其进行了验证和稳定性考察。
WANG Chun-e，LU Xu，Liu Ｒu-feng，SHI Ji-chun，LI Hong，CHEN Qiong，Tang Jing，CHEN Cui-ping，YE Qiang National Institutes for Food and Drug Control，Key Laboratory of Method and Standardization for Quality Control of Biotechnical Products，Ministry of Public Health，Beijing 100050，China Corresponding author： YE Qiang，E-mail： qiangyee@ nifdc． org． cn
1． 1 菌株 NG 菌株（ CMCC 29105、29106、29400、 29403、29805、29806、29807、29808、29816、29818 ） ， 非 NG 菌株［铜绿假单胞菌株（ CMCC 10104） 、金黄 色 葡 萄 球 菌 株 （ CMCC 26001 ） 、脑 膜 炎 奈 瑟 菌 株 （ CMCC 29018 ） 、脑膜炎奈瑟菌株 （ CMCC 29204 ） 、 干酪乳杆菌株（ CMCC 34103） 、大肠埃希菌株（ CMCC 44103） 、变形杆菌株 （ CMCC 49102 ） 、伤寒沙门 菌 株 （ CMCC 50096 ） 、福 氏 志 贺 氏 菌 株 （ CMCC 51573） 、白色念珠菌株（ CMCC 98001） ］均来源于中 国医学细菌保藏管理中心。 1． 2 主要试剂及仪器 （ PCＲ-荧光探针法） NG 核 酸检测试剂盒 A 和 NG 核酸检测试剂盒 B 均为中山 大学达安基因股份有限公司产品； NG 核酸检测试剂 盒 C 为上海科华生物工程股份有限公司产品； NG 核 酸检测试剂盒 D 为上海之江生物科技股份有限公司 产品； 沙眼衣原体 / NG 核酸检测试剂盒 E（ 多重实时 荧光 PCＲ 法） 为 Cepheid AB 公司产品。注射用生理 盐水、GC 基础培养基、血红蛋白粉、Vitox Supplement 均购自 Oxoid 公司； 普通营养琼脂、MＲS 培养基均购 自 BD 公司。显微镜（ OLYMPUS BX51） 、细菌计数板 （ THOMA HELBEＲ） 、标准细菌比浊管均由中国食品 药品检定研究院提供； 荧光定量 PCＲ 仪（ ABI7500） 购 自 ABI 公司； 全自动医用 PCＲ 分析系统（ GeneXpert Dx） 购自 Cepheid AB 公司。 1． 3 菌株的培养 选择适宜的培养基将菌株进行 复苏、传代培养。将 NG 菌株接种至 GC 培养基上， 于 37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培养 18 h，刮取新鲜培养 物进行形态 学、生 理 生 化 特 性 鉴 定，并 提 取 基 因 组 DNA 进行分子生物学特征分析； 将脑膜炎奈瑟菌接 种至巧克力色琼脂培养基上，于 37 ℃ 、5% CO2 培养 箱中培养 18 h，刮取新鲜培养物进行形态学、生理生 化特性鉴定； 干酪乳杆菌接种至 MＲS 培养基，于 37 ℃ 培养箱中过夜培养； 白色念珠菌接种至改良马丁 培养基，于 25 ℃ 培养箱中过夜培养； 其余菌株分别
参考品，然后利用 5 种不同来源的 NG 核酸检测试剂盒验证各种参考品，并考察参考品在不同处理条件下的稳定
性。结果 每株菌在各自适宜的培养基和温度下培养后，均生长良好，无杂菌污染。经 5 种试剂盒验证检测，10 份
阳性参考品的检测结果均为阳性，10 份阴性参考品的检测结果均为阴性，精密性参考品检测结果为 Ct 值的 CV 均
微生物学免疫学进展 2016 年 10 月第 44 卷第 5 期 Prog in Microbiol Immunol，Oct． 2016，Vol． 44 No． 5
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淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒国家参考品的制备
王春娥，卢旭，刘茹凤，石继春，李红，陈琼，唐静，陈翠萍，叶强
中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050
摘要： 目的 制备淋病奈瑟菌（ Neisseria gonorrhoeae，NG） 核酸检测试剂盒国家参考品。方法 分别将 10 株 NG 和
10 株非 NG 参考菌株在各自适宜的培养基和温度下培养，收获新鲜无污染培养物，用比浊法和显微计数法将不同
的培养物制备成 10 份 NG 菌悬液阳性参考品、5 份精密性参考品和 10 份非 NG 菌悬液阴性参考品以及最低检出限
基金项目： 国家科技基础条件平台国家微生物资源平台奖补经费资 助项目（ NIMＲ 2015-2）
作者简介： 王春娥（ 1980－） ，女，助理研究员，主要从事医学微生物菌 种资源的收集、保藏及相关科研。
通讯作者： 叶强，主任技师，E-mail： qiangyee@ nifdc． org． cn
淋病奈瑟菌（ Neisseria gonorrhoeae，NG） 属革兰 阴性球菌，为严格的人体寄生菌。NG 可引起人类 泌尿生殖系统化脓性感染（ 俗称淋病） ，淋病是中国 发病率较高的性传播疾病之一，早期发现和有效治
接种至营养琼脂培养基，于 37 ℃ 培养箱中过夜培 养。 1． 4 参考品原菌液的定值 1． 4． 1 阳性、阴性及精密度参考品原菌液的定值
除干酪乳杆菌采用活菌计数法外，其余参考品的 定值采用比浊法。分别选取生长良好且无污染的菌 种，用一次性接种环刮取新鲜培养物至灭菌生理盐 水中，制备菌悬液，采用标准细菌比浊管比浊后，用 灭菌生理盐水稀释至 1 ×108 / mL，灭活后分装，于 － 20 ℃ 以下保存。干酪乳杆菌菌悬液用灭菌生理盐 水稀释至约 1 ×108 / mL 后，10 倍系列稀释至 10－6 数 量级，取 10－4 、10－5 、10－6 数量级菌悬液涂布平皿，进 行活菌计数。根据计数结果稀释至 1×108 / mL，灭活 后分装，于－20 ℃ 以下保存。 1． 4． 2 最低检出限参考品原菌液的定值 采用显 微计数法和活菌计数法。用一次性接种环刮取 NG （ CMCC 29818） 新鲜培养物至灭菌生理盐水中，制 备菌悬液。菌悬液用标准细菌比浊管进行比浊后， 参考比浊浓度取 样 进 行 显 微 计 数［16］。 同 时 进 行 活 菌计数： 将菌悬液用灭菌生理盐水稀释至约 108 / mL 后，10 倍系列稀释至 10－6 数量级，取 10－4 、10－5 、10－6 数量级菌悬液涂布平皿，37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培 养后计数。根据计数结果稀释至 1×107 / mL，灭活后 分装，于－20 ℃ 以下保存。 1． 5 参考品的制备 1． 5． 1 阳性参考品 分别将 10 株 NG 原菌液稀释 至 106 / mL，定量分装，0． 5 mL / 管，于－20 ℃ 以下保 存，即 NG-P1 ～ NG-P10。 1． 5． 2 阴性参考品 分别将 10 株阴性参考品菌株 的原菌液稀释至 106 / mL，定量分装，0． 5 mL / 管，于－ 20 ℃ 以下保存，即 NG-N1 ～ NG-N10。 1． 5． 3 精 密 性 参 考 品 将 NG 原 菌 液 （ CMCC 29818） 稀释至 106 / mL，定量分装，1． 0 mL / 管，于 － 20 ℃ 以下保存，即 NG-Ｒ，5 份 / 套。 1． 5． 4 最低检出限参考品 将最低检出限参考品 菌株原菌液（ CMCC 29818） 稀释至 105 / mL，定量分 装，0． 5 mL / 管，于－20 ℃ 以下保存，即 NG-S。 1． 6 分装均匀度 随机抽取阳性参考品、最低检出 限参考品各 5 支，精密性参考品 14 支，用试剂盒 E 进行检测，计算 Ct 值的 CV 值。 1． 7 参考品的验证 按照试剂盒 A ～ E 的说明书 方法检测参考品，并对其进行验证。 1． 7． 1 准确性 检测 10 份阳性参考品，要求均为 阳性。
小于 5． 0% ； 5 种试剂盒的最低检出限均能达到 1 000 / mL，其中试剂盒 B 和 E 的最低检出限达 100 / mL。参考品在 2
～ 8 ℃ 放置 7 d、3 7 ℃ 放置 3 d 的热稳定性及反复冻融 5 次以内的稳定性良好。结论 制备的 NG 核酸检测试剂盒
国家参考品的准确性、特异性及精密性均符合要求，可用于 NG 核酸检测试剂盒的质量评价。
Abstract： Objective To prepare the national reference for the detection kit of neisseria gonorrhoeae nucleic acid． Method s Allof 10 strains of neisseria gonorrhoeae and 10 strains of non-neisseria gonorrhoeae were cultured in a suitable media and temperature，then fresh and uncontaminated cultures were collected． The preparation of references was carried out in bacterial susponsion of both 10 positive reference of neisseria gonorrhoeae and 10 negtive reference of non-neisseria gonorrhoeae，bacterial susponsion of 5 precision reference，and a bacterial susponsion of minimal detection limit reference by turbidimetry and microscopic counting． The references were verified by five PCＲ detection kits for neisseria gonorrhoeae from different companies，and evaluated by stability test under various conditions． Ｒesults Each from all strains grew well in its own suitable media and temperature，and the cultures were not contaminated． The detections showed correct results for 10 positive and 10 negative references，respectively，and the CV were all less than 5． 0% for tested results of precision by verification of the five PCＲ detection kits． A bacterial concentration of 1 000 / mL was determined by the five kits，and a concentration of 100 / mL determined by the kit No． B and E． The stability tests showed good results on the references after stored at 2－8 ℃ for 7 days，or 37 ℃ for 3 days，or 5 cycles of freezing-thawing，respectively． Conclusion The accuracy， specificity，reproducibility can met the relevant requirements for the prepared national references，which could be used in evaluation of quality control of PCＲ detection kit for neisseria gonorrhoeae nucleic acid． Key words： Neisseria gonorrhoeae； Nucleic acid； Kit； Ｒeference
关键词： 淋病奈瑟菌； 核酸； 试剂盒； 参考品
中图分类号： Ｒ392-33
源自文库
文献标志码： A
文章编号： 1005-5673（ 2016） 05-0021-05
DOI： 10． 13309 / j． cnki． pmi． 2016． 05． 004
Preparation of national reference for detection kit of neisseria gonorrhoeae nucleic acid
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微生物学免疫学进展 2016 年 10 月第 44 卷第 5 期 Prog in Microbiol Immunol，Oct． 2016，Vol． 44 No． 5
疗是控制 NG 感染的有效措施［1－2］。NG 核酸检测 以其快速、灵敏成为诊断 NG 感染的主流方法［3－5］， 目前国内 NG 核酸检测试剂盒已有 10 多家企业被 批准上市，国家参考品是科学、公正评价体外诊断试 剂质量的重 要 物 质 和 依 据，根 据《体 外 诊 断 试 剂 注 册管理办法》相关规定［6－7］，为评价和控制 NG 核酸 检测试剂盒质量，实验制备了 NG 核酸检测试剂盒 国家参考品，并对其进行了验证和稳定性考察。
WANG Chun-e，LU Xu，Liu Ｒu-feng，SHI Ji-chun，LI Hong，CHEN Qiong，Tang Jing，CHEN Cui-ping，YE Qiang National Institutes for Food and Drug Control，Key Laboratory of Method and Standardization for Quality Control of Biotechnical Products，Ministry of Public Health，Beijing 100050，China Corresponding author： YE Qiang，E-mail： qiangyee@ nifdc． org． cn