第三章 细胞分离与胞内产物的溶解

31
n
n
超声波破碎是细胞破碎中的一种普通方法，在许多实 验室研究或生化物质的分离制备中都能见到，但是要 向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很因难的，故 在工业范围中还未采用这种破碎方法。 一般来讲杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌较阳性菌 易破碎，对酵母菌的效果较差。
32
不同机械破碎方法的比较
技术
匀浆法 (孔型)
原理
效果 成本
举例
珠磨破 碎法
超声波 法 研磨法 匀浆法 (片型)
须使细胞通过的小 剧烈 适中 细胞悬浮液大规模 处理 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物 珠捣碎 细胞的大规模处理 用超声波的空穴作 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模 用使细胞破碎 处理 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中 动物组织及动物细 胞
27
3）超声波破碎



超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。
28
超声波破碎的机理

高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，0℃左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。
19
高压匀浆法适用的范围
革兰氏 阴性细菌 10-13 nm
酵母菌 100-300nm
真菌 霉菌 100-250nm
层次
单层
多层
多层
葡聚糖(30-40%) 甘露聚糖(30%) 蛋白质(6-8%) 脂类(8.513.5%)
多层
多聚糖 (80-90%) 脂类 蛋白质
主要 肽聚糖(40-90%) 肽聚糖 (5-10%) 组成 多糖 脂蛋白 胞壁酸 脂多糖(11-22%) 蛋白质 磷脂 脂多糖(1-4%) 蛋白质
2
路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
本章内容
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
3
概述
n
n
n
n
微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢产 物，以及细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶、淀粉 酶等等，称为胞外产物。 但有些目的产物存在于细胞内部，如大多数的酶、蛋白、类 脂等，称为胞内产物。 自80年代以来，基因工程广泛应用，许多具有重要价值的生 物产品应运而生，如胰岛素、白细胞介素、干扰素等。许多 基因工程产物都是胞内产物，分离提取这些产物时，首先必 须将细胞破碎，使产物释放，才能进一步提取分离。 因此，破碎技术已引起了基因工程专家和生化工程专家的极 大关注。
珠磨机破碎作用方程

破碎作用是相对于时间的一级反应速度 过程，符合下列公式：
ln[1/(1-R)]=Kt

3-2
R — 破碎率；K- 一级反应速度常数；t-时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、 玻璃小珠装量和珠体直径以及温度等相关。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分 子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不 易分离而给后续操作带来的困难。
30
超声波破碎的效率与声能、声频、处理时间、 细胞浓度及菌种类型有关。
(1)振幅：振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 (2)细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑制空穴现象。 (3)表面张力：添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性 物质(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。因为强 烈起泡在气-液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特 别是应用高的功率时。 (4)被处理悬浮液的体积：大体积需要高的声能引起强烈的 涡流和大的气泡形成。 (5)探头的形状和材料。

25
Netzsch LM-20型珠磨机

园盘以两种位臵交错地安装在轴上， 一种处于径向，一种与轴倾斜， 径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动 由于交错的运动，提高了破碎效率。
A-具有冷却夹套的圆筒形磨室 B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘 C-环形震动侠缝分离器 D-变速马达 1和2料液进出口 3和4 搅拌冷却剂进出口 26 5和6磨室冷却剂进出口
12
3.2 细胞破碎技术
破碎方式 机械法 非机械法
固体剪切 作用 压榨 研磨
液体剪切 作用 高 压 匀 浆 超 声 破 碎
干燥 处理 酶溶法
溶胞 作用 化学法 物理法
珠磨法
13
细胞破碎方法及其原理
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
23
2）珠磨法 bead mill


珠磨是常用的方法
细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨 剂（直径小于1mm）一起快速 搅拌或研磨，研磨剂、珠子 与细胞之间的互相剪切、碰 撞，使细胞破碎，释放出内 含物。 在工业规模的破碎中，常采 WSK卧式高效全能珠磨机 用高速珠磨机 24

高速珠磨机工作原理
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
6
细菌细胞壁结构
大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎， 生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基 上容易破碎。
22
高压匀浆法-X-挤压器




改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至25℃至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的 高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋 在冰中的细胞变形所引起的。 主要用于实验室中。 优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的 粉碎程度低以及活性的保留率高 对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。



一般认为在超声波作用下液体发生空化作用 （cavitation), 液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大 的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞 上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从 而使细胞破碎。 操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或 外部冷却的容器中进行。
JY92-II D超声波
药物名称
胰岛素
宿主
大肠杆菌
用途
治疗糖尿病
人生长激素
α-干扰素
大肠杆菌
大肠杆菌
治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血病等
8
酵母细胞壁的结构示意图
最里层是由葡聚糖的细纤维 组成，它构成了细胞壁的刚 性骨架，使细胞具有一定的 形状， 上面的是一层糖蛋白， 最外层是甘露聚糖，由1,6磷酸二酯键连接成网状。在 该层的内部，有甘露聚糖酶的复合物。 破碎酵母细胞壁的阻力主要 决定于壁结构交联的紧密程 度和它的厚度。
4
概 述
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破
坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产 物成分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌
型生化物质（产品）的基础。
为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了
解各种微生物细胞壁的组成和结构。
5
3.1 细胞壁结构对破碎的影响
第三章 微生物细胞破碎
1
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 离心，过滤 ) ( 细胞分离 离心，过滤 ( ) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 溶解( 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳) 层析、电泳 ) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩(超过滤) 浓缩( 超过滤) 精制( 结晶、干燥) 结晶、干燥 )

9
真菌的细胞壁



真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次 还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同， 其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚 糖构成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的 强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此， 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。
10

红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的 混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
11
细胞壁的组成和结构
微生 物 壁厚
革兰氏 阳性细菌 20-80 nm
磨室内放臵玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器 高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动； 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起 在出口处，旋转园盘和出口平 板之间的狭缝很小，可阻挡玻 离小珠，使不被料液带出。 由于操作过程中会产生热量， 故磨室还装有冷却夹套，以冷 却细胞悬浮液和玻璃小珠。
—大规模细胞破碎的常用方法 ☆高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 ☆不宜使用高压匀浆法。


易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀 浆阀）
20
影响高压匀浆器细胞破碎因素
被破碎的细胞分率符合如下公式： ln[1/(1-R)]=KNPɑ (3-1) 式中 R — 破碎率，为N次循环后，蛋白 质的释放量Rn与最大释放量Rm之比； K － 与温度有关的速度常数； P － 操作压力，MPa； ɑ－ 与微生物种类有关的常数。
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
使细胞具有一定的形状和强 度。
7
细菌细胞壁结构



破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存 在的肽键的数量和其交联的程度。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大 不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种 细胞生产了很多细胞重组的产物。
15
1.高压匀浆法 （High-pressure homogenization）
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。
细胞悬浮液自高压室针 形阀喷出时，每秒速度 高达几百米，高速喷出 的浆液又射到静止的撞 击环上，被迫改变方向 从出口管流出。细胞在 阀杆 这一系列高速运动过程 阀座 撞击环 阀杆 中经历了高速剪切、碰 压力控制手轮 撞及压力骤降，造成细 APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构 胞破碎。
细胞粉碎机
29
超声波破碎的适用范围




超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破 碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大， 但在实验室小规模细胞破碎中常用。
机械破碎 物理破碎
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法 有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
14
化学破碎
酶促破碎
一、机械法
机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）
21
影响高压匀浆器细胞破碎因素

升高压力有利于破碎，




减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几 乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p 超生一定值时，R增加但很慢。 在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。
破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同
16
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
17
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多：


WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
高压匀浆机
18
高压匀浆法使用时注意事项