单克隆抗体研究进展

国内已经获批生产的部分单抗产品
公司名称 武汉生物制品研究所 商品名 通用名 注射用抗人T细胞CD3鼠单抗 适应症 器官移植排异
东莞宏逸士生物技术药业
恩博克大连亚维药业 上海中信国健药业 上海美恩生物技术 百泰生物药业 上海赛金生物医药 上海中信国健药业 益赛普 唯美生 泰欣生 强克 健尼哌
抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏
特点：1.高特异性；2.高均一性；3.高单一性。
2.单克隆抗体制备的基本原理
致敏B淋巴细胞( sensitized B cells ) (能够分泌特异性的抗体 ，不
能在体外长期生存) 1
(myeloma) ×骨髓瘤细胞 (不能分泌特异性的抗体，但能在体外
长期生存)
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阳性杂交瘤细胞(hybridoma)
优越性：
1.与噬菌体展示技术和转基因技术相比，由于其完全属于体外操作系统， 无需 依赖细胞技术和毒性蛋白对宿主菌生长的影响，不受体内环境的限制，扩大了 展示文库的库容量和分子多样性。
2.核糖体展示技术无需进行体内外系统转化，全程只需通过PCR技术复制、扩 增，使得其建库时间缩短，筛选简便。PCR技术还可引入突变，增加分子多样 性，从而获得高亲和力抗体。
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1
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克隆化培养 （产生单克隆的阳性 杂交瘤细胞）
单克隆抗体
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生产单抗
3.单克隆抗体制备过程
4.研究进展
4.1鼠源性抗体
技术：B淋巴细胞杂交瘤技术。 主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的 筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗 的鉴定等。 不足：鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反 应，产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)， 这在很大程度上限制了mAbs的临床应用。此外，鼠源性的 mAbs不能与人类抗体FcRn结合。
国内准备或已涉足单抗产业的上市公司有中信国健、百泰生物、 华神集团、丽珠集团、复星医药、双鹭药业、国药一致、 海正药业、 独一味、沃森生物等。中信国健、百泰生物更是国内这一行业的佼佼 者。中信国健依托丰富产品线，是国内抗体药物领域领军者；百泰生 物引进古巴先进技术，打造了我国首个人源化单抗“泰欣生”。
生命科学学院 遗传学 冯 刚
1.定义：
抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特 异性结合的免疫球蛋白。 单克隆抗体(monoclonal antibody)是由淋巴细胞杂交瘤 产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的 特异性抗体。 1975年，淋巴细胞杂交瘤技术由Kohler和Milstein建立。
目前已建立的噬菌体展示系统，如：丝状噬菌体、l噬菌体、T4噬菌体、 T7噬菌体和真核病毒系统等。 特点：实现了直接将基因型和表现型完美的结合在一起， 可以快速而高 效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体。
存在的问题： (1)抗体亲和力相对较弱; (2)抗体多样性无法满足。
(2)转基因小鼠技术
该技术至今还未发展完全，其转基因片段较小，且相邻基因片段 高度同源，重组过程复杂，在面对抗原多样性时，无法完全产生 相应的抗体。
抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏 注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白 碘[131I]肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液 尼妥珠单抗注射液 注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白 重组抗CD25人源化单克隆抗体注射液
源自文库
银屑病
银屑病 类风湿关节炎等 肝癌治疗 结直肠癌 强直性脊柱炎 抗移植排斥
优点：人源化程度能达到70%以上， 有利于其在临床试验中的应用与
研究。
4.2.3全人源化抗体
制备方法：噬菌体展示技术和转基因小鼠技术。
(1)噬菌体展示技术
基本原理： 将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因通过基因工程技术 随机插入噬菌体的外壳蛋白基因，继而感染大肠杆菌，经增殖并以抗体 片段Fab或ScFv外壳蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；利用靶分 子，经过“亲和-洗脱-扩增-亲和”循环过程筛选，除去杂蛋白并富集特 异性抗体。
4.3核糖体展示技术
基本原理：利用PCR 扩增含目的基因的cDNA 文库，再加上启动
子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译偶联系统作用下，形 成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，用相应抗原反复筛选复合 物，分离mRNA，通过RT-PCR 富集目的基因，并将目的基因导入 表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工 程抗体库。
不足：由于具有支持作用的FR不仅为CDR的构象提供了环境，还参与抗体 结合位点正确构象的形成和抗原的结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力 和特异性大大降低，有的甚至还丧失了抗原结合能力。
解决方案：选用与鼠源单抗具有高度同源性的人源抗体，但保留鼠源单抗 中的一些关键氨基酸残基，并在此基础上，对鼠CDR和FR的一些表面氨基 酸残基进行修饰或重塑，对关键氨基酸残基进行一定的改变，能在保留 CDR移植抗体的亲和力和特异性下，大大降低其免疫原性。
目前，我国的单克隆抗体产业已经形成了以北京、上海、西安以及武汉等产 业化基地。而单克隆抗体也发展到了第四代，我国已经上市的单抗药物多为鼠源 性，正在研究中的多为嵌合或者人源化单抗，而全人源单抗还没有。而在全球的 单克隆抗体市场，全人源化单克隆抗体是其未来的发展方向。在FDA批准上市的 80多种基因工程和抗体工程产品中，抗 体类产品有26种，其中18种为人源化抗 体。
我国单克隆抗体药物研发进展情况
近年来中国的单抗技术已经受到越来越多的关注和重视，单克隆抗体药物 研究已被列入863计划和国家重点攻关项目。“十二五”期间，我国“重 大新药创制”专项，中央财政下拨资金100亿元，配套资金300亿元。专项 战略重点包括创新药物研究开发、药物大品种技术改造等。恶性肿瘤、心 脑血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、肺结核等10类重大疾病药物的研 发是创制资金支持重点。 目前，中国已经上市的抗体只有20多个（截止到2010年7月），绝大多数 在临床研究或已经上市的品种为完全仿制国外上市的产品,年销售约1亿美 元，生产水平低、规模小，制约了单抗药物在中国的发展，我国政府和企 业已经逐渐意识到抗体药物的安全性和有效性以及巨大的市场效益，在抗 体新靶标发现、抗体大规模表达等产业化等方面发展迅速，投入逐渐增加， 有望在5～10年内达到国际先进水平。“十二五”和“十三五”是我国抗体 产业发展的黄金期，到了“十三五”期间，目前居全球前十位的抗体药物 基本都能在我国实现产业化生产。
4.2人源化抗体
主要包括嵌合抗体、改型抗体 和全人源化抗体。
4.2.1嵌合抗体指的是鼠mAbs的恒定区 基因被人Abs的恒定区基因通过基因重 组技术所替换而编码产生的单克隆抗体。 这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得 的单抗降低了在人体内的免疫反应。
4.2.2CDR移植抗体，又称改型抗体，是在嵌合抗 体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的 FR代替鼠FR，形成的只剩3个鼠源CDR的、更为 完全的人源化抗体。
3.目前还有很多研究表明，核糖体展示技术还能提高小分子抗体的稳定性，如 三结构域抗体(VH/K)可以明显改进ScFv的稳定性。 存在的问题： 1.mRNA 易降解。 2.“蛋白质-核糖体-mRNA” 三元复合物的稳定性也较 差。 解决方案： 1.目前已有研究表明，氧钒核糖核苷复合物(VRC)作为过渡阶段的类似 物发生作用，可有效地抑制核酸酶，提高mRNA的稳定性。 2.在缓冲液中加入一定浓度的镁离子、交联核糖体RNA 的磷酸基团， 可抑制核糖体复合物的解离。