胡继红 下呼吸道感染细菌培养操作规范 _花脸稿_解读资料

当有大量炎症细胞，且：
敏百度文库性
G+双球菌,诊断肺炎链球菌： 57% G-小杆菌,诊断流感嗜血杆菌： 82%
特异性
97% 99%
4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义
库什曼螺旋纤维
呈毛虫状蜷曲，革兰染色可见中轴蓝染，边 缘淡红色。因慢性炎症时细支气管分泌的粘液浓 缩而成。
夏科雷登结晶
可见于支气管，为菱形或针状六边形无色透 明结晶，其两端尖长，大小不等，折光性强，由 嗜酸粒细胞破裂后嗜酸性颗粒相互融合而成, 可 用碘染色。可在稍放置的痰中找到嗜酸性粒细胞 堆。在对烟曲菌有变态反应的哮喘患者或肺部感 染寄生虫患者的痰液中常见。
类型/免疫状态
最常见病原菌
少见病原菌
免疫抑制宿主条件致 社区获得性肺炎典型菌，
病菌感染性肺炎
奴卡菌属，念珠菌属，条
件致病真菌，曲霉菌
环境暴露3 引起的肺炎 双相真菌、曲霉属、肺炎 鼻疽假单胞菌，假鼻疽
支原体、肺炎衣原体
假单胞菌，鼠疫耶尔森
菌，贝纳柯克斯体、图
拉热弗朗西斯菌
急性气管炎
病毒，百日咳博德特菌，
类型/免疫状态
社区获得性 典型肺炎1
最常见病原菌
少见病原菌
肺炎链球菌，流感嗜血杆菌， 金黄色葡萄球菌，卡他莫
肺炎克雷伯菌
拉菌，脑膜炎奈瑟菌
社区获得性 非典型肺炎2 肺炎支原体，呼吸道病毒， 流感病毒，肺炎衣原体， 军团菌属
吸入性肺炎
厌氧菌，金黄色葡萄球菌， 需氧G-b
沙眼衣原体，结核分枝杆 菌，真菌等
应用范围：针对医疗机构微生物实验室； 检验项目：常规细菌培养检测下呼吸道感染病原菌； 操作流程：按分析前、分析中和分析后的顺序书写； 引言：是全篇的背景知识； 三个“规范性附录”：结果报告的重要依据。
内容—— 定性培养——痰/气管吸出物； 定量培养——支气管纤维镜采集标本； 快速排除和鉴别——重要致病菌的方法； QC——培养基和试剂的质量控制； 细菌培养报告——需结合革兰染色涂片结果；
3.1.3 血培养 注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养
标本采集和送检要求） 3.1.4 诱导痰（通常不用于细菌培养） 3.1.5 气管镜标本
3.1.5.1 采集气管镜标本注意事项 3.5.1.2 支气管肺泡灌洗液标本(BAL)
3.5.1.3 保护毛刷(PSB)
3.2 标本运送
Standard for Bacterial Culture Procedures of Lower Respiratory Tract Infections
主要起草人：卫生部临床检验中心 胡继红
标本最多
判断难 报告难 不符合
• 大多数微生物室：40-60%/日
• 标本是否合格？ • 定植菌？致病菌？ • 生长不同种类细菌如何报告？ • 生长不同数量细菌取舍？ • 前后两天培养结果 • 培养结果与临床诊断
痰的来源？ 是否被上呼吸道污染？
草绿色链球菌、奈瑟菌属 嗜血杆菌属、莫拉菌属
细胞内病原引起非典型肺炎：
•肺炎支原体 •肺炎/鹦鹉热衣原体 •嗜肺军团菌 •柯克斯体（Q热）
常见引起细菌性社区感染典型肺炎病原菌：
• 肺炎链球菌
• 流感嗜血杆菌
• 金黄色葡萄球
• 卡他莫拉菌
上呼吸道正常菌群
卫生部临床检验中心 陕西省人民医院 安徽省立医院 卫生部北京医院 北京大学人民医院 中国医学科学院北京协和医院 首都医科大学附属北京友谊医院 解放军总医院 浙江省温州医科大学附属第二医院
清除机制：
健康宿主吸入口腔定植菌后常无临床症状，细菌 通常被粘液柱状纤维清除。
吸入能否引起肺部感染取决于： 吸入菌的致病性及数量； 患者免疫系统； 呼吸道功能等诸方面的因素。
2）吸入气溶胶肺部感染占第二位： 主因：使用了不清洁的呼吸机。
3）血液播散性肺炎占第三位：
感染通常造成双肺下叶肺炎。由呼吸道感染引发 的菌血症占12%，因此对肺部感染的高热患者送 检血培养，有利于发现肺部感染的病原菌。
3.3 筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本
拒收24h内重复采集的痰细菌培养标本 唾液 鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子 咽部标本 未经保护套管收集的支气管刷培养标本 痰的厌氧菌培养标本 注：除支气管穿刺吸出物、 PSB 、活检标本、胸水或其他未经污染以外的标本做厌氧菌培
养均不合格。 诱导痰 注：诱导痰标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差。
4.1.2 接种标本
4.1.3 培养
4.1.4 标本涂片及革兰染色
注 1 ：革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异。 1 ） 95% 乙醇脱色时间为 30s ； 2 ） 丙酮- 乙醇
（体积比为 3:7, 棕色瓶室温保存，有效期 1 年）脱色时间 1s ～5s ，脱色效果一致性好；
7 Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manresa,and F.Gudiol.2000.Prospective study of sputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiring hospitalization.Clin.Infec.Dis.31:869-874.
弹性纤维 肺组织有破坏性病变如肺脓肿、肺癌等时，痰中
可出现弹性纤维，证明痰液标本来自下呼吸道。
纤毛柱状上皮细胞 纤毛柱状上皮细胞主要分布在下呼吸道内表面，在
柱状细胞的游离面附有能摆动的纤毛，是能分泌粘液的
借助纤毛有节律性的摆动，将含有灰尘、细菌的粘液排 除至喉部。
肺泡巨噬细胞 来自血中单核细胞，脱落的Ⅱ型肺泡上皮或肺泡间
医院获得性肺炎
G-b (肠杆菌属/克雷伯菌属/不 动杆菌属/假单胞菌属)，
金黄色葡萄球菌，厌氧菌， 社区获得性肺炎的典型菌
军团菌，肺炎链球菌
血液播散性肺炎
金黄色葡萄球菌，链球菌
需氧革兰阴性杆菌
注1：肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是引起儿童和老年人肺炎的最常见致病菌；卡他莫拉菌、脑膜炎球菌多发
于: 基础病患者或病毒感染后的继发感染；金黄色葡萄球菌肺炎可引发肺脓肿；肺炎克雷伯菌大叶性肺炎 常合并脓肿或肺粘连，死亡率较高。
报告的临床意义和格式内容。
（1）明确：下呼吸道标本 适合诊断的病原和检验项目 ； （ 2 ）规定：细菌培养项目需同时做革兰染色涂片—— （ 培养 + 药敏 + 涂片）； （ 3 ）规范：痰培养 / 气管吸出物的 定性培养 程序、气管镜
采集标本的 定量培养 程序； （ 4 ）明确：报告 的临床意义和格式内容 。
隔细胞。细胞体积大，胞质丰富，核圆形、卵圆形或肾 形，略偏位，染色质细致均匀，偶见核仁，涂片中有巨 噬细胞证明痰液标本来自下呼吸道。
3.1 标本采集 3.1.1 咳痰 3.1.2 气管吸出物
注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本， 否则勿培养气管吸出物，因气管在插管 24h 后即有定植菌，培养结果 可能与疾病不符。
分析前
标本的采集、运送
标本初筛、合格判断
分析中 定性、定量培养、涂片流程
病原菌筛查和鉴定、质量控制
分析后
染色、培养结果报告（致病菌、非致病菌）、结果解释
内容
1.口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响
肺部感染的影响因素 ( 定植菌变化：健康人 G+ 免疫、基础病 /住院、用抗菌药物 G-b )
2.肺部感染的常见机制
菌、流感嗜血杆菌（具侵袭性）定植数量会增加；
基础条件变化：使用免疫抑制剂、慢性肺病、广谱抗菌药物治疗或住院患 者等人群中，革兰阴性杆菌的优势明显增加。
常见因素： 住院患者（48h后）：
病毒感染 抗菌药物
——继发细菌感染 ——杀死、抑制正常菌群，使G-b、耐药
菌过度繁殖，如大肠埃希菌、铜绿假单胞
8 Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,and R.Martin.1988.Sputum gram stain assessment in community-acquired bacteremic pneumonia.J.Clin.Microbiol.26:846-849.
除引起社区非典型肺炎的病原不能常规培养外，其他常 见肺部感染的病原菌均可常规培养方法分离；
但培养方法敏感性低，无法判断分离菌的来源。
涂片革兰染色方法： 评价痰标本是否合格； 提高病原菌诊断的特异性； 涂片还可发现培养不能生长的细菌。 涂片方法提高了培养方法的特异性及敏感性。
注 1 ：若送检标本超过 2h，将导致有临床意义的致病菌数量减少，非苛养的口咽部定植 菌过度生长。为防止口咽部正常菌群的过度生长，可将标本放置 2 ℃～ 8 ℃环境，但 培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量会减少。
注 2 ：若标本延迟送检超过 2h后未冷藏（超过 2h～24h， 2 ℃～ 8 ℃），应在报告中说明因 延误送检标本，可能对培养结果造成的影响。
3 叶应妩, 等.全国临床检验操作规程(第3版). 2006
4 美国微生物学会:《临床微生物学手册》(第10版).2011
5 美国微生物学会:《临床微生物学手册》(第9版).2006
6 Nagendra, S., P.Bourbeau, S.Brecher, M.Dunne, M.LaRocco, and G.Doern.2001.Sampling variability in the microbiological evaluation of expectorated sputa and endotracheal aspirates. J. Clin. Microbiol.39:2344-2347.
胡继红 任健康 马筱玲 胡云建 王辉 徐英春 苏建荣 罗燕萍 李向阳
1 美国微生物学会:《临床微生物学操作手册》（第3版）.2007.
（Clinical Microbiology Procedures Handbook）
2 美国微生物学会:《下呼吸道感染》临床微生物学检验技术及操作系列丛书.2004
4.1 痰及气管吸出物标本处理 4.1.1 标本处理要求
接种标本及涂片操作必须在Ⅱ级生物安全柜中进行； 应尽快处理所有标本，特别是来自急诊、新入院患者和有创方法采集的标本（如：BAL和肺
活检标本），以保证致病菌的活性，避免造成重复采集标本；
使用全自动接种前处理系统的实验室按厂家说明书处理标本，洗痰、液化后自动接种和涂片 革兰染色。
5.下呼吸道感染细菌培养的局限性
培养结果假阴性、假阳性的原因
附录A 汇总表
附录B 汇总表
人类口咽部定植：需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌等微生物； 菌群总数：1010 ～1012CFU/mL;
健康人咽部定植菌特点： 1. 菌量～最少； 2. 需氧的正常菌群组成：革兰阳性菌为主； 3. 影响因素：人体基础条件变化影响定植菌群的种类和数量；（微生态） 举例：长期接触携带定植菌人群菌群会变化，如日托儿童的父母的肺炎链球
菌、不动杆菌、阴沟肠杆菌等； 定植菌：肠道菌，MRSA，多重耐药菌
损害
——机械通气（ICU）
侵入性仪器
嗜麦芽窄食单胞菌 鲍曼不动杆菌
引起医院获得性感染
1）肺部感染的最常见机制： 肺泡内吸入了口咽部定植菌；
吸入性肺炎患者咽部菌群种类： 多侵袭性细菌或耐药细菌，如肺炎链球菌或革兰 阴性杆菌。
肺炎支原体和肺炎衣原体
注2：通常可用分子生物学方法快速诊断，也可在感染后期用血清学方法检测肺炎支原体、肺炎衣 原体和军团菌属抗体确诊。由生物恐怖病原菌，如和鼠疫耶尔森菌引起的感染，血清学检测 可作为辅助诊断方法。结核分枝杆菌可用罗氏培养基或快速结核杆菌液体培养仪培养，或分 子诊断方法检测。
注3：暴露在特殊气溶胶环境：与飞沫有关的结核分枝杆菌、与尘暴和鸟排泄物有关的双相真菌等。
主要机制：吸入定植菌；吸入气溶胶；血播性； 附录 A: “下呼吸道感染的主要类型及主要病原菌”
3.痰涂片对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用
痰培养：敏感性低 / 培养+ 涂片 ：提高特异性和敏感性
4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义
特异性 82% ～91% ，诊断价值远高于痰标本； 附录 B : “适合诊断的病原及检验项目”