影响电化学免疫传感器性能因素研究

摘 要
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电化学免疫传感器是一组，生物化学，免疫学，物理学和技术的发展相互渗透的其他学科，具有独特的优点：如选择性好，灵敏度高，检测速度快。关于提高它的性能的研究也越来越多。本文用三电极体系以及循环伏安法共同建立电化学传感器的实验条件，并研究传感器的各种性能。使用筛选出来的材料（分析试验数据得到的）制作出了各种性能良好的电极和反应池，并建立了良好的电化学免疫传感器检测系统。该实验研究的传感器的传感器性能是通过使用成熟和简单的操作的恒电位法建立的。这次简单的试验就凸显出了传感器的优良特性，如果后期改变设计方案和实验研究思路，将传感器将应用在反应快速、准确检测分析和疫病诊断等领域是完全没有问题的，但有一点不足之处值得一提，就是试验结果与偏差相比有些差异，所以这是传感器目前不能用于定量分析的原因。
关键词：三电极体系；性能研究；电化学免疫传感器
ABSTRACT
Electrochemical immunosensor is a group, biochemistry, immunology, mutual penetration of the physics and technology, the development of other disciplines, with unique advantages: such as good selectivity, high sensitivity, detection speed quickly. The research on improving its performance is also increasing.. In this paper, the experimental conditions of electrochemical sensor were established by three electrode system and cyclic voltammetry, and the performance of the sensor was studied.. Using the material obtained from the screening, the electrode and the reaction cell with good properties were produced, and a good electrochemical immune sensor detection system was established.. The sensor performance of the sensor is established by using the constant potential method of the mature and simple operation.. This simple test highlights the excellent characteristics of sensor, if the latter change design and experimental research, the sensor will be used in rapid response, accurate detection analysis and disease diagnosis of the field is no problem, but there are some shortcomings worth mentioning, is to test the results with deviation compared to some of the differences, so this is sensor at present can not be used for quantitative analysis of the reasons.
Keywords: three electrode system; performance study; electrochemical immune sensor












影响电化学免疫传感器性能因素研究
席 温 新
（天津农学院 工程技术学院）
1 引言
1.1 研究目的和意义
如今，科技的飞速发展和人民生活水平的不断提高，环境污染越来越严重，破坏了生态环境，使得人们对环境中的“环境激素”倍感忧虑。从而促进了电化学分析法更进一步的发展，继而生产出了较精准的电化学免疫传感器。免疫传感器的特

点有很多，比如：选择多样化、简单的操作系统化、很高的灵敏度和可以叠加使用等等，这些特点已在军事科学，临床医学以及环境监测方面出现了十分广阔的前景，可见未来的发展前景也很可观。但是由于电化学免疫传感器的性能的还不稳定，因此该类传感器不能批量生产。本文对该类传感器的性能进行了研究，并做出进一步探究。
1.2 研究现状及发展趋势
电化学免疫传感器具有操作简单，设备简单，特异性高等方面的优点，所以在市场上有广泛的应用前景。它包括电流型，电位型，电容型，阻抗型免疫传感器，具有响应时间短，使用寿命长，灵敏度高，适于在线监测等优点，引起了好多专家学者的兴趣。有的传感器研究发展并不完善，难以满足人们对化学免疫传感器的需求，因此需要寻求更好的发展。今后电化学免疫传感器的发展如表1所示；解决这些问题主要途径如表2。
表1：电化学免疫传感器的发展
表2：解决问题的途径
1.2.1电化学的分析方法
电化学分析法是利用物质的电学、电化学性质及其变化而建立起来的分析方法。电分析化学的发展是密切相关的前沿科学的发展，其发展有着悠久的历史。形式和内容的现代电分析化学分析，更对电极过程理论，生命科学，能源科学，信息科学和环境科学意义有着非凡的发展。随着计算机技术的发展、纳米技术、电子技术的发展，循环伏安法、差分脉冲伏安法、线性扫描伏安法、交流阻抗法、计时电流法等一系列更为复杂细致且较为灵巧的方法已经运用到了电化学实验中。
简言之电化学分析(biochemical analysis)，是将待测试液与适当的电极构成一个化学电池，然后根据材料的组成和化学电池的内容和一些电的测试之间的测量关系的参数分析。电化学分析灵敏度较高；准确度高；测量范围宽；价格低，调试和操作也是简单的，并且很容易实现自动化。
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1.2.2传感器性能研究
免疫传感器是物理化学换能器与生物活性材料交叉结合的产物。传感器的最初设想是由Lyons和Clark于1962年提出的。随着21世纪知识经济的发展，生物传感器被广泛应用于工业控制，临床医学，食品分析，生物芯片，环保和生物技术的研究。1962年，里昂和克拉克开发出第一代生物传感器。同年，第一电位酶传感器是由Guiltily和Monumental共同研制出来的。如今，我们的酶传感器的研究也有了很大的进步，主要表现在高，新技术的酶传感器的应用，防止流失电子介体和酶，提高了固定化酶技术的活性，并扩大载波选择和其他方面的范围。
免疫传感器是新兴的新型的生物传感器的一种，它应用电化学免疫分析法。

随着社会的进步和人类的发展，科研人员对传感器的性能方面的改进也越来越高，免疫传感器的发展必要因素之一就是它的研究领域涉及到环境和临床医学方面，这将给人类带来飞速的发展。
2 电化学免疫传感器的原理
电化学免疫传感器利用抗体和抗原之间的特异性的组合，改变其电化学信号，使敏感元件（生物组分）固定在载体膜上，即免疫传感器的敏感膜（接收器），电极作为转换元件，传感器的反应信号通过转换器再与电信号结合为放大信号，最后通过电子系统进行处理和显示。电化学免疫传感器的原理图如图1所示。
图1 电化学传感器原理示意图
3 电化学免疫传感器性能探究
3.1检测方法对免疫传感器检测精度的影响
差分脉冲伏安法，是一种电化学测量手段，是连续的阶跃信号，是线性扫描伏安法和阶梯扫描伏安法的衍生方法，即在其基础之上添加一定的电压脉冲。在电势改变之前测量电流，通过这种方式来减小充电电流的影响。因为电势改变时间点不好控制，因此舍弃此种方法。
线性扫描伏安法，扫描的不断进行使得电流急剧上升，电极表面上的还原物的浓度受到电极电位变化的影响，而过了波峰，电流开始减少还受到扩散层增大的影响。对于一个不可逆的电极过程中，由于速度慢的电极反应，在快速扫描电极反应速度与极化的速度，伏安曲线不会出现峰值电流，因此只能选择较慢的电势扫描速率，把其速率控制在0．001～0．1V/s。其次，工作电极是一种静态汞电极，汞电极或一实心电极（可极化），而辅助电极和参比电极具有相对较大的表面面积（未偏振，即不可极化）。根据电流- 电位曲线，峰值电流与被测物的浓度可以被认为是线性的，并且可用于定量分析，也就是，该方法被用于吸附材料的确定。
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交流阻抗法，也称为电化学阻抗谱，就是一系列的频率的正弦波讯号产生的阻抗频谱。电化学阻抗谱法是以小振幅的正弦波电位作为扰动信号的电化学测量方法。对于一个稳定的线性系统中，当响应和干扰，阻抗Z和导纳Y在系统的内部结构决定之间存在的唯一的因果关系，反映在系统中的频率响应特性。使用此方法有太多约束，因此成为了舍弃的理由。
计时电流法，用于电子转移动力学的研究。近年来还出现了双电位阶的计时电流法（即电化学系统的工作电极的步骤之后测量电流响应和时间的函数。）这种方法应用到化学反应，或化学反应的反应机制的电极是固定的。
循环伏安法，可以通过控制循环的数量控制聚合物膜的厚度，能够以良好的性能得到聚合物膜。充电和放电的电极、该反应

的可逆性和的稳定性的特性环状充电和放电被广泛用。也经常被用作电极反应机制的研究。实验可以分别对不同缓冲体系、不同pH、不同扫描速度、实验次数、不同初始浓度等因素做出循环伏安曲线。它的工作原理是随着时间的电位线性变化，并记录在同一时间的电流响应信号，然后电势和电流便获得了。然后，将获得的工作电极的电化学信息。 CV曲线的曲线在不同的扫描速度获得不同的电极材料是不一样的，因此，可以有很多的性能分析，如：在电极电容，周期，电阻反应，可逆反应等。
图2示出了在所施加的电压。选定电位的扫描范围介于E1至E2和扫描速率的模式的改变，从开始势E1到E2，然后到反向扫描从E2到E1。由图3可见,循环伏安图有两个峰电流和两个峰电位。inc和 IPA分别表示阴极峰值电流和阳极峰值电流，对应的阴极峰值电位与阳极峰值电位分别为Enc和Ape。
图2 循环伏安法的典型激发信号
图3 CL溶液中的K3Fe(CN)6K的循环伏安图
用循环伏安法测定铁氰化钾的电极反应过程，实验操作简单，数据易得，测试结果很好，可行性好，可以广泛应用于电化学及其相关领域。
3.2电极的选取及工作电极的制作对特性的影响
3.2.1电极的选取
测量技术分为两电极体系(工作电极和参比电极)、三电极体系（工作电极、参比电极和辅助电极）和四电极体系（参比电极、感受电极、工作电极或第二参比电极和辅助电极）、三种。因为四电极体系主要应用在研究 液/液 界面电化学的时候和涉及大电流时候，本设计均不采用；
因为在三电极系统中，电流不通过参与比电极，以使工作电极和辅助电极相对于两电极系统的工作电极和参考之间的电压比电极之间的电压更稳定，所以采用三电极体系大量的实验研究。而且三电极体系其电流电位都可以测量，而且测量精度也很高。
工作电极的表面发生电极反应，该系统由辅助电极流至工作电极的工作电流，而参比电极内阻无限大，而参比电压的表面上的电极反应没有电流通过，这可确保了电位的恒定。但与氧化还原反应的深入，工作电极反应的物质浓度下降，变更了三电极电位的表面上，该系统稳定性发生了改变，从而影响了实验测量。通过使用恒电势电路，使用三个电极电位闭环负反馈调节系统保持在一个稳定的状态，从而解决了由于长的反应时间和电极电位的问题的影响，使结果更加准确。此外，三个电极必须放置在溶液中进行测试，使用溶液抗体对抗原（珠）吸附的磁珠固定到三电极表面所测得的浓度值转换为对应于当前值。
3.2.2 工作电极的制作与包埋
三电极的工作电极选用铂

电极，其作用是在电极表面产生化学反应。工作电极用0．1mm直径的铂丝做成半球状，将其粘接固定在一个塑料环中，然后将其叠合粘接在参比电极上，就构成了三电极微型电解池。在使用铂电极之前，要用酸碱反复清洗，并在0．025molfL的氯化钾溶液中，于0.2一O.6V电压范围内，进行循环扫描，直至电流基线稳定为止。这样就保证工作电极的重复性良好和电场分布均匀。
该传感器的性能有灵敏度的影响和传感器的选择性。嵌入方法的选择对免疫传感器的制备中重要的影响，嵌入的方法包括包埋法，共价结合法，吸附法，自组装法，电化学聚合方法和交联的方法。
吸附方法具有操作简单，条件温和，对生物分子的活性几乎没有影响的优点，且成本低，但溶液的pH值，温度，离子强度，在该电极基底是在生物学组分容易跌倒敏感关闭。
交联的优点是操作简单。它的生物组分的固定牢固，这是不容易脱落的。它的缺点是，反应难以控制，且扩散阻力大，以及所需的生物试样的量多。
包埋实验条件是非常温和的，有许多不同种类的聚合物凝胶和活性作用的生物体成分上是非常小的，直径的聚合物膜和厚度可以得到控制，所述包封材料不泄漏，所述底物分子可以是任意的扩散在膜中。然而，在凝胶网格分子量衬底的扩散将是困难的，而且有许多实验条件需要控制。
共价键法固定过程简单，制备的电极存储稳定性好，可对有机磷农药进行高灵敏、快速检测。
电化学聚合和固定是可以在一个步骤中完成的生物组分，它的聚合层的厚度和生物组数量的聚集的电化学聚合方法容易控制并具有良好的再现性，抗干扰能力强的传感器的结构是强。
3.3信号采集与处理方式对特性的影响
3.3.1信号采集
信号采集系统是收集模拟信号转换该计算机能识别的数字信号，然后通过计算机是对应于计算和处理，获得所需要的数据，显示该数据，以实现对物理量实时监测是测量。信号采集模块由四变换电路组成，IV阶低通滤波器电路和AD转换。IV转换的作用是将电流信号转换为电压信号的装置；二阶低通滤波器电路是高频干扰信号进行滤波，而不电压信号的干扰输出稳定； AD转换是采集模拟信号转换成电压信号由MCU进行处理。
AD / DA位数对精度的影响：精度和系统中有关测量控制信号范围内，但据估计，考虑到其它因素，转换器数量应该比最低分辨率率的总准确度要高一位。常见的AD / DA器件具有8位，10位，12位，14位，16位等等。
数据处理：
（1）根据数据得出阴、阳极峰电位差△E。
（2）计算相同实验条件下阳极峰电流与阴极峰电流的比

值IPA / inc，得出的结论为：比值不变。
（3）保证扫描速度恒定，且K3Fe(CN)6浓度相同，以横坐标为阳（阴）极峰电流，纵坐标为扫描速度的平方根作图，得出的结论为：扫描速度在50mV/s-100mV/s之间，这不仅能保证仪器的正常使用而且使实验数据更加准确，也保证传感器的灵敏度准确。
（4）保证扫描速度恒定，且K3Fe(CN)6浓度相同，以阴（阳）极峰电流为横坐标，K3Fe(CN)6的浓度为纵坐标作图，得出的结论为：该传感器在-0.10×A到+0.6×A的范围内保持良好的线性关系。
（5）根据实验结果说明K3Fe(CN)6在KNO3溶液中电极反应过程的可逆性。
然后再把传感器获取的数据，进行不同系统的最佳组合，并获得更高的精度，
用来评价提高传感器的性能。
3.4传感器的动静态参数的选取对其性能的影响
实验的试剂为的K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)溶液，里面混合了饱和KNO3（1.0mol）电解质溶液，整个实验过程都在500ml的烧杯中进行。
3.4.1 静态性能实验探究
3.4.1.1线性度实验
配置五组等浓度的铁氰化钾溶液，分别为： 、、、、，其中的辅助溶剂都为0.1mol/L的KNO3溶液，(点位扫描范围为：-0.6V到+0.6V)扫描速度设定为25mV/S。此免疫传感器的电流响应值是由免疫传感器与溶液的不同梯度的反应来确定的。扫描速度为25m V/s时的峰电流i与铁氰化钾的浓度c关系图如图4：
图4 扫描速度为25m V/s时的峰电流i与铁氰化钾的浓度c关系图
具体的数值如表3所示：
表3 峰电流与浓度的关系
实验结果表明，该传感器在-0.10×A到+0.6×A的范围内保持良好的线性关系。
3.4.1.2 灵敏度实验
选取浓度为1.0×10-3M的铁氰化钾溶液，使得扫描速度分别为25mV/S，50mV/S，100mV/S，200mV/S，进行实验探究。
表4 扫描速度与峰电流的关系
图5 铁氰化钾浓度为4.0x10-3M时峰电流i与扫描速度的平方根v1/2关系图
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扫描速度的增加，正峰电流和负峰电流之间的差越来越大，由于扫描速度太小，离子扩散效果越来越小，所以正峰电流和负峰电流偏移越来越小，使得结果更加准确。但扫描速度太小，很可能会影响实验的时间，而且还会使电极自我腐蚀，造成电极极化，它还会影响试验的精确度，所以在实验过程中，扫描速度是严格控制在为50mV/ s的-100mV的/ s间，这不仅能保证正常使用仪器，而且使实验数据更加准确，也保证传感器的灵敏度准确。
3.4.1.3 重现性实验
为保证实验中工作电极的重复性良好，必须进行合适的电极预处理工作，来保证氧化还原、外表形态和不吸附杂质的可重现条件。所以先用蒸馏水清洗一下金电极，清洗完之后放在阳光下暴晒，目的是杀毒，然后再用氮气吹干。制

备和清洗液体电极比较容易，因为电极表面重现性较好。
在其他保持不变的情况下，选择配置溶液浓度为1.0×10-3M铁氰化钾溶液时间为5组10小时重复性试验，扫描速度设置为25mV/ S的间隔。每个测试周期结束之后是解密封处理。在同一时间，同一修复过程的电极，以确保各实验条件相同，实验数据如表5所示。
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表5 峰电流与实验次数的关系
结果表明，在做好前期处理工作之后，每次都保证实验的峰电流不变，在时间段相同的情况下增加试验次数，实验数据基本重现，所以传感器的稳定性良好。
3.4.1.4 抗扰性实验
抗扰能力检测的是溶液中仪器的电极对的待测抗原的独特性测试。其中，实验所需的酶用明胶标记，即将3mg的血清滴进250ml的缓冲溶液中制成抗原溶液，再与等体积的丝素蛋白溶液充分混合，
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并在室温下暴晒裸金电极使其干燥。然后在溶液中加入与其他干扰物质的浓度。结果表明，所述干扰抗体不影响的真实性，和对照组（这是非干扰物质的成员），以获得峰值电流的曲线几乎重合。相差微小，不足以造成误差，此实验表明仪器的抗干扰能力很强。
3.4.1.5 特异性实验
将免疫传感器浸在含1.0×10-3M标准铁氰化钾溶液中后，在电解质中测定其电流响应。然后在铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）标准溶液中分别加入等量的FeCl2，H Cl、FeCl3以达到对其电流相应时间的测定。有测定结果得出，在标准溶液中加入FeCl2和H Cl 溶液时，被检测到的电流值减小到 %和 %。在溶液中加入FeCl3时，电流响应值是原来的 ％。结果说明抗体上的决定簇决定了与目标物质结构越相似，特异性反应越差。
3.4.2 动态性能实验探究
3.4.2.1 电位响应时间实验
免疫传感器的电位响应受到PH值得影响很大，采用控制变量法，研究改变溶液PH值（5.5—8.5）对免疫传感器电流响应的影响，数据如表7所示。
表7 PH值与峰电流的关系
pH 值 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
峰电流
结果表明：pH 在5.5至7.4之间，氧化峰电流会达到最小值；pH 7.4—8.5，pH逐渐增大，伴随着峰电流的逐步增大。表明pH=7．4时，抗原抗体结合产生的复合物紧紧地附着在免疫传感器的电极层面上，这样才导致电流值降到最小值。
4 结论
本课题只从两方面（动、静态）进行研究，测试了免疫传感器的性能，并通过实验得出以下结论：该传感器，无论是其静态性能方面，还是其动态性能方面，都是良好的。
由于我个人的能力以及实验条件有限，我觉得还有下面两点可以改进：
①固化抗原抗体的方法也可以采用更好的交联方法。
②可以用集成芯片（精度较高）进行数据采集，可以使得实验结

果更准确并且提高了仪器的分辨率。
【参 考 文 献】
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