第五章 工程酶—人工酶

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武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
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①诱导法
是根据化学反应的过渡态理论,模仿酶催化作用, 是根据化学反应的过渡态理论,模仿酶催化作用,设计 合成一种底物的稳定过渡态化合物的类似物,作为半抗原 合成一种底物的稳定过渡态化合物的类似物, 无抗原性),再将其共价结合到载体蛋白( ),再将其共价结合到载体蛋白 (无抗原性),再将其共价结合到载体蛋白(通常是牛血 清白蛋白) 构成抗原,用它注射哺乳动物,使其B淋 清白蛋白)上,构成抗原,用它注射哺乳动物,使其 淋 巴细胞产生针对这个抗原的抗体。 巴细胞产生针对这个抗原的抗体。
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抗原被注射 入鼠体内
取出脾脏 分离出淋巴 细胞B
培养的骨 髓瘤细胞 骨髓瘤细胞 两种细胞融合生成杂交瘤 细胞
细胞转移到特殊 培养介质中,只 有杂交瘤细胞能 生长,其它细胞 死亡
培养杂交瘤细胞并产生和 分泌出单一抗体
来自百度文库
单克隆抗体筛选技术制备抗体酶
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抗体酶的发展前景 迄今为止, 迄今为止,获得的抗体酶已能成功的催化六种 类型的酶促反应和几十种类型的化学反应。 类型的酶促反应和几十种类型的化学反应。这些抗 体酶的催化专一性相当于或者超过一般酶的反应专 一性,催化速度有的也可以达到酶的催化水平。 一性,催化速度有的也可以达到酶的催化水平。 在抗体酶研究过程中,可以直接观察到过渡态 在抗体酶研究过程中, 理论对抗体酶设计所起到的重要作用。另一方面, 理论对抗体酶设计所起到的重要作用。另一方面, 抗体酶在有机合成和有机反应机制研究方面, 抗体酶在有机合成和有机反应机制研究方面,也引 起了有机化学家的广泛兴趣。抗体酶的应用, 起了有机化学家的广泛兴趣。抗体酶的应用,使酶 促反应在有机合成中显示出广阔的前景。 促反应在有机合成中显示出广阔的前景。
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③引入法
借助于基因工程和蛋白质工程方法将催化基团引入到已 有底物结合能力的抗体的抗原结合部位上。 有底物结合能力的抗体的抗原结合部位上。如果引入的催 化基团与底物结合部位取相正确,空间排布恰到好处, 化基团与底物结合部位取相正确,空间排布恰到好处,则 就会产生高活性的抗体酶。 就会产生高活性的抗体酶。
工程酶( 第五章 工程酶(Ⅱ)
第一节 概述 工程酶的概念 工程酶是指应用某种技术操作 对天然酶进行性能优化 是指应用某种技术操作, 工程酶是指应用某种技术操作,对天然酶进行性能优化 和其它人为研制的各种生物催化剂的统称。 人为研制的各种生物催化剂的统称 和其它人为研制的各种生物催化剂的统称。
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)、抗体酶的筛选 虽然用PCR和噬菌体技术构建 (2)、抗体酶的筛选 虽然用 )、 和噬菌体技术构建 的庞大Fab蛋白组合库,可绕过动物免疫,直接从库中 蛋白组合库, 的庞大 蛋白组合库 可绕过动物免疫, 筛选有用的抗体,从而大大促进抗体酶的生产, 筛选有用的抗体,从而大大促进抗体酶的生产,但面 对巨大的免疫系统资源, 对巨大的免疫系统资源,目前的筛选方法只能筛选出 其中的一小部分抗体。 其中的一小部分抗体。一般是通过对半抗原的结合力 来筛选的,而不是通过催化活性来筛选, 来筛选的,而不是通过催化活性来筛选,问题是对半 抗原亲和力最大的,不一定是最好的催化抗体。 抗原亲和力最大的,不一定是最好的催化抗体。有人 在制备含硒抗体酶时就遇到这个问题。 在制备含硒抗体酶时就遇到这个问题。如筛选半抗原 亲和力小的抗体,其谷胱甘肽过氧化物酶反而高很多。 亲和力小的抗体,其谷胱甘肽过氧化物酶反而高很多。 因此, 因此,这是对开发通过催化活性直接筛选抗体酶的一 个挑战,但可以满怀信心的说, 个挑战,但可以满怀信心的说,这个问题是能够解决 的。
基因突变
突变蛋白质
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定位突变( ①定位突变( site-directed mutagenesis )
在编码酶蛋白的基因的特定位点进行突变的方法。 在编码酶蛋白的基因的特定位点进行突变的方法。 定位突变是对酶蛋白进行有目的改进的强有力的方法之一。 定位突变是对酶蛋白进行有目的改进的强有力的方法之一。 应用基因定位诱变技术修饰酶基因, 应用基因定位诱变技术修饰酶基因,经典的方法是寡核苷酸 诱导的定位诱变。 诱导的定位诱变。 Sigel等人用定位突变的方法成功地将质粒pBR322上 Sigel等人用定位突变的方法成功地将质粒pBR322上 等人用定位突变的方法成功地将质粒pBR322 编码β 内酰胺酶活性部位的Ser 70的密码子AGC突变 Ser- 的密码子AGC 编码β-内酰胺酶活性部位的Ser-70的密码子AGC突变 为编码Cys的密码子TGC 突变的β Cys的密码子TGC。 为编码Cys的密码子TGC。突变的β-内酰胺酶分解氨 苄青霉素(Amp)的能力大幅下降。 苄青霉素(Amp)的能力大幅下降。
+
催化部分 结合部分
选择性融合
杂化酶
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1、抗体杂化酶 、
利用抗体蛋白作为母体,引入适当的催化活性中心,是构 建杂化酶的一个可行途径。
S-S
~~ S—S~~CHO
HS
应用这种方法,已经成功地将亲核 的—SH引进抗体(MOPC-315)的结 合部位附近。这种抗体杂化酶可以提高 酯的硫解速率达60 000倍。
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(3) 抗体酶专一性。从经济观点出发,和酶催化一样,抗 抗体酶专一性。从经济观点出发,和酶催化一样, 体酶的高度专一性是个缺点, 体酶的高度专一性是个缺点,因为对每一个底物和每一个 反应都需要不同的催化剂。因而,开发能催化多种底物的 反应都需要不同的催化剂。因而, 抗体显然是应用研究的追求目标。 抗体显然是应用研究的追求目标。这种多用途催化抗体已 出现。 出现。Lerner小组原来设计的水解四氢吡喃乙缩醛的抗体 小组原来设计的水解四氢吡喃乙缩醛的抗体 14D9,后来发现还能催化烯醇醚水解,环氧化物的形成和 ,后来发现还能催化烯醇醚水解, 开环。 开环。 (4) 底物抑制。与过渡态最相近的两个稳定的结构是反应物 底物抑制。 和产物。结合基态过紧, 和产物。结合基态过紧,由于提高了反应活化能而使催化效 率降低,而产物结合过紧则抑制转化效果。 率降低,而产物结合过紧则抑制转化效果。后者对键形成反 应特别严重: 应特别严重:因为两个强束缚结构间键的形成会加强二者的 结合(螯合效应)。 )。最好的解决办法是建立的半抗原在结构 结合(螯合效应)。最好的解决办法是建立的半抗原在结构 上要与产物有显著差异。 上要与产物有显著差异。
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抗体酶的理论基础 抗体是哺乳动物脾脏的B细胞在外界 抗体是哺乳动物脾脏的 细胞在外界 抗原物质(如细菌、病毒、蛋白质等) 抗原物质(如细菌、病毒、蛋白质等) 刺激下,所合成的一类球状蛋白质, 刺激下,所合成的一类球状蛋白质, 亦即免疫球蛋白( ), ),能专一识别 亦即免疫球蛋白(Ig),能专一识别 并结合抗原(即抗原结合部位), ),形 并结合抗原(即抗原结合部位),形 成抗原—抗体符合物 抗体符合物。 成抗原 抗体符合物。 酶活性中心与底物过渡态结合理论。 酶活性中心与底物过渡态结合理论。酶在催化底物 发生化学变化过程中,酶活性中心的主要功能是与底 发生化学变化过程中, 物的过渡态结合,并起稳定作用。可以设想, 物的过渡态结合,并起稳定作用。可以设想,如果构 建一个对某种过渡态具有最佳缔合状态的抗体, 建一个对某种过渡态具有最佳缔合状态的抗体,就有 可能观察到抗体催化相应底物发生化学反应的效果。 可能观察到抗体催化相应底物发生化学反应的效果。
常规酶 天然酶 极端酶 固定化酶 化学修饰酶 生物催化 剂(酶) 工程酶 生物工程酶 人工酶 化学工程酶 模拟酶 印迹酶
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修饰酶
物理修饰酶 基因工程修饰酶 克隆酶、抗体酶、 克隆酶、抗体酶、 杂合酶、 杂合酶、进化酶
第二节 生物工程酶 一、基因克隆酶
基因克隆酶研制的主要目的, 基因克隆酶研制的主要目的, 是把人或动植物酶基因在微生 物细胞中表达, 物细胞中表达,大量生产有用 的功能酶。 的功能酶。 迄今为止, 迄今为止,已克隆的酶基因 愈千种,有许多已经商品化。 愈千种,有许多已经商品化。
基因克隆的大致步骤
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突变酶(基因修饰酶) 二、突变酶(基因修饰酶)
通过改变酶基因的DNA序列来改变 通过改变酶基因的DNA序列来改变 DNA 酶的性质, 酶的性质,由此产生的遗传修饰酶 称为突变酶或基因修饰酶。 称为突变酶或基因修饰酶。 天然酶
常用的DNA突变方法主要有三类: 常用的DNA突变方法主要有三类: DNA突变方法主要有三类 ①定位突变 ②随机突变 ③定位—随机突变 定位—
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随机突变( ②随机突变( random mutagenesis )
随机突变是指在基因序列上随机改换碱基的一种突变 方法。 • 物理方法 (如X-射线处理) • 化学的方法 (亚硝酸钠、吖啶橙等)
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基因克隆的大致步骤
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基因克隆是各种基因工程、 基因克隆是各种基因工程、 蛋白质工程的基本操作, 蛋白质工程的基本操作,大 致有系列步骤: 致有系列步骤: ①从含目的酶丰富的(也可 从含目的酶丰富的( 能是“稀少”的)生物细胞 能是“稀少” 分离含目的酶基因的DNA 中,分离含目的酶基因的DNA 片段; 片段; ②将目的酶基因DNA与载体 将目的酶基因DNA与载体 DNA DNA连接 连接; DNA连接; ③将重组体导入受体细胞; 将重组体导入受体细胞; ④筛选出目的酶基因高效表 达的细胞株, 达的细胞株,用于生产克隆 酶。
S-S
S—TpG-O-寡聚核苷酸
5‘—AGAGTTTAAAGAGAGAATTTTTAGCGGCTTGTGCGGGAAT—3’
5‘—AGAGTTTAAAGAGAGAATTTTTAGCGGCTTGTGCGGGAAT—3’ 3’—TCGCCGAACACGCCC—5‘
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四、抗体酶 1986年,美国《Science》周刊同时发表了两 篇来自由Lerner和Schultz分别领导的两个研究组 有关如何发现具有酶催化性质的抗体研究报告。 她们用Abzyme来命名新发现的具有酶催化活性 的抗体,中文译名为抗体酶。Abzyme的本质为 免疫球蛋白(Ig),但是在易变区被赋予了酶的 属性,所以又被称为催化抗体(Catalytic antibody)。
②拷贝法
拷贝法操作步骤比较简单,先用已知酶作为抗原免疫动物, 拷贝法操作步骤比较简单,先用已知酶作为抗原免疫动物, 获得了抗酶的抗体,再将这种抗体免疫动物进行单克隆化即 获得了抗酶的抗体, 获得了单克隆的抗抗体,将后者进行筛选, 获得了单克隆的抗抗体,将后者进行筛选,应获得具有原酶 活性的抗体(抗体酶)。 活性的抗体(抗体酶)。
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2、核酸水解杂化酶 、 核酸水解杂化酶是以非选择性的具有水解DNA或 RNA磷酸二酯键性质的核酸水解酶为母体,在酶的 活性中心邻近位点引进一个识别部分,如一段寡聚 核苷酸等,得到能够对核酸进行定位切割的杂化核 酸酶
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HN O=
近年来,定位—随机突变已成为分子酶学的核心方法。
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三、杂化酶
杂化酶是一种半合成酶,它是以天然蛋白质为母体,用化 学方法引进适当活性部分,从而形成一种新的“人工酶”。 两种类型: a、以具有特异性识别功能的蛋白(如抗体)为母体,引 进催化功能部分; b、以具有催化活性的蛋白(非专一选择性酶)为母体, 引进特殊识别功能部分。
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尽管抗体酶研究取得很大进展, 尽管抗体酶研究取得很大进展,但离实际应用还有一定 的距离,目前以下几个问题亟待解决。 的距离,目前以下几个问题亟待解决。 (1)、催化效率。抗体酶是不对称合成的理想催化剂, (1)、催化效率。抗体酶是不对称合成的理想催化剂,其 催化反应的范围十分广泛,而且还在不断扩大,然而, 催化反应的范围十分广泛,而且还在不断扩大,然而,催 化抗体现在还未达到实用阶段。对实用来说,来源, 化抗体现在还未达到实用阶段。对实用来说,来源,费用 和可靠性都是要考虑的因素, 和可靠性都是要考虑的因素,但能否实用的关键因素是催 化效率;反应的时间是否合理, 化效率;反应的时间是否合理,反应的效率是否可以接受 与酶的催化速度相比, 。与酶的催化速度相比,目前所得到的大部分催化抗体的 反应速度加强只能是中等水平的。因此, 反应速度加强只能是中等水平的。因此,如何提高抗体酶 的催化效率,抗体酶将来能否与酶竞争是个公开挑战。 的催化效率,抗体酶将来能否与酶竞争是个公开挑战。
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