莽草酸生物合成途径的调控

酸化反应，使莽草酸累积。 野生型菌株有两个莽草 酸激酶同工酶，包括激酶Ⅰ和激酶Ⅱ，分别由基因 aroK 和 aroL 编 码 ， 激 酶Ⅱ是 转 化 过 程 中 的 主 要 催 化 酶 ，而 激 酶 Ⅰ的 酶 活 力 有 限 。 敲 除 aroL 基 因 ， 保 留 aroK 基 因 ， 使 微 生 物 细 胞 保 留 微 弱 的 莽 草 酸 激 酶活性以便累积莽草酸的同时还能自身合成芳香 族氨基酸和维生素 等物质而无需额外添 加[4]。 此外， 利 用 P1 噬 菌 体 作 介 质 ，使 Tn10 和 CmR 基 因 分 别 插 入 aroL 的 478 位 碱 基 对 和 aroK 的 17 位 碱 基 对 ，通 过完全缺失莽草酸激酶活力以切断下游生化反应， 使 得 合 成 的 莽 草 酸 无 消 耗 而 大 量 累 积[5]。
1 莽草酸生物合成途径
莽草酸途径是芳香族氨基酸合成过程中的一 段共同代谢途径（图 2）。 葡萄糖经糖酵解和磷酸戊 糖 途 径 分 别 生 成 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 （PEP） 和 赤 藓 糖-4-磷 酸 （E4P）， 两 者 在 3-脱 氧-阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸7-磷 酸 （DAHP） 合 成 酶 的 催 化 下 进 入 莽 草 酸 途 径 ，
图 1 莽草酸结构式
获得莽草酸的方法有多种， 主要包括生物提 取、化学合成和生物合成。与动物细胞不同，植物和 微生物细胞普遍能合成莽草酸。 木兰科植物八角茴 香的果实是工业上获得莽草酸的主要来源，其莽草
酸 含 量 为 10％以 上 。 由 于 八 角 茴 香 属 于 木 兰 科 东 方 小型树种结出的果实， 分布在全球极少数地区，产 量受气候等自然环境影响较大，严重限制了莽草酸 的产量。 化学合成莽草酸有多种途径，但产率不高， 如 Diels-Alder 和 逆 Diels-Alder 反 应 合 成 法 的 产 率 都 只 有 15％左 右 ，且 工 艺 复 杂 。 生 物 合 成 法 是 利 用 经过改造的微生物大规模发酵生产莽草酸的方法， 即以经过基因修饰得到的大肠杆菌为生产菌株，以 葡萄糖为原料大规模发酵合成莽草酸。 大肠杆菌体 内莽草酸合成途径的关键酶与莽草酸产量的高低 关系密切，因此，对莽草酸合成过程中的关键酶及 其调控进行深入研究，有助于提高莽草酸的产量。
Abstract： Shikimic acid as precursor for biosynthesis of alkaloid and other compounds，has been concerned recently as the key material for the synthesis of tamiflus that is the only one effective clinic drug against avian influenza. In this paper，functions of key enzymes in the biosynthesis pathway of shikimic acid were analyzed，and the breeding of engineering bacterium by genetic improvements for high yield of shikimic acid was also discussed.
解 除 3-脱 氧-阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸-7-磷 酸 （DAHP） 合成酶的反馈抑制是增加莽草酸产量的另一关键 因 素 。 DAHP 的 3 个 同 工 酶 分 别 由 aroF、aroG、aroH 编 码 ，其 酶 活 力 的 比 值 大 约 为 25∶75∶<1。 用 3 种 芳 香族氨基酸的类似物分别筛选到对特定氨基酸反 馈抑制不敏感的突变株。 研究表明，当突变株 DAHP 合 成 酶 aroF 基 因 的 第 443 位 碱 基 由 C 变 成 T，酶 的 148 号 氨 基 酸 残 基 由 原 来 的 Pro 转 变 为 Leu 时 ， 此 突 变 株 对 酪 氨 酸 反 馈 抑 制 不 敏 感[6]。 将 该 突 变 基 因 导 入 菌 株 中 ，能 够 解 除 DAHP 合 成 酶 受 酪 氨 酸 反 馈 抑制，引导更多的底物进入莽草酸合成途径。
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2009 年第 3 期
汪华等：莽草酸生物合成途径的调控
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① 3-脱 氧 -阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸 -7-磷 酸 合 成 酶 （3-deoxy-d-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase） ； ② 脱 氢 奎 尼 酸 合 成 酶 （3-dehydroquinic acid synthase） ；③ 脱 氢 奎 尼 酸 脱 水 酶 （3-dehydroquinic acid dehydratase） ； ④ 莽 草 酸 脱 氢 酶 （shikimate dehydrogenase） ； ⑤ 莽 草 酸 激 酶 (shikimate kinase) ；⑥5-烯 醇 丙 酮 酰 莽 草 酸 -3-磷 酸 合 成 酶 （5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase） ；⑦ 脱 氢 圭 尼 酸 脱 氢 酶 （dehydroquinate dehydrogenase） ；⑧ 脱 氢 莽 草 酸 脱 水 酶 （dehdroshikimate dehydratase）
2 莽草酸合成途径的分子生物学改造
在野生型菌株中，莽草酸是芳香族氨基酸合成 途径的中间代谢物，不会在细胞内累积，为了获得 大量的莽草酸， 必须切断或限制下游生化反应。 Marco 等[3]敲 除 5-烯 醇 丙 酮 酰 莽 草 酸-3-磷 酸 合 成 酶 基 因 ， 使 莽 草 酸-3-磷 酸 大 量 累 积 ， 后 者 去 磷 酸 化 后 就获得目标产物。 敲除莽草酸激酶能阻断莽草酸磷
基 因 tktA 编 码 的 转 酮 酶 对 赤 藓 糖-4-磷 酸 合 成 量 有 重 要 影 响 。 李 永 辉 等 [7]从 大 肠 杆 菌 K-12 株 中
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
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扩 增 了 基 因 tktA，该 基 因 在 工 程 菌 中 的 高 效 表 达 使 转 铜 酶 的 活 性 提 高 了 3.9 倍 ，DAHP 的 合 成 量 提 高 明 显 。 David 等 [8]通 过 增 加 tktA 的 拷 贝 数 提 高 了 转 酮 酶 的 活 力 ， 使 得 赤 藓 糖-4-磷 酸 合 成 量 增 加 ， 最 终 进入莽草酸代谢途径的碳量增加为原来的两倍，莽 草 酸 合 成 途 径 的 总 产 率 由 20% 上 升 到 29% ， 副 产 物圭尼酸和 3-脱氢莽草酸的产量分别由 8.1 g/L 提 高 到 19 g/L 和 6.5 g/L 提 高 到 11 g/L， 但 莽 草 酸 的 产 量 仅 由 26 g/L 上 升 为 28 g/L。 可 以 看 出 ，tktA 基 因的过量表达增加了底物合成量，但副产物的过多 合成消耗了底物，使得莽草酸的合成量没有明显提 升。 3.2 提高磷酸烯醇式丙酮酸的利用率
Draths 等[5]将对酪氨酸反馈抑制不敏感的 DAHP 合 成 酶 基 因 （aroFFBR）导 入 莽 草 酸 激 酶 活 性 完 全 缺 失 的大肠杆菌细胞内，同时为了提高脱氢圭尼酸合成 酶 （ 基 因 aroB 编 码 ） 活 力 及 补 偿 莽 草 酸 脱 氢 酶 （ 基 因 aroE 编 码 ） 活 力 ， 增 加 了 aroB 和 aroE 基 因 拷 贝 数，构建了莽草酸生产菌株。 结果表明，以葡萄糖为 原 料 ， 补 料 分 批 发 酵 培 养 42 h， 获 得 莽 草 酸 27.2 g/ L； 圭 尼 酸 12.6 g/L； 脱 氢 莽 草 酸 4.4 g/L， 莽 草 酸 有 明显的累积。
磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 （PEP） 是 一 种 高 能 化 合 物 ， 在 葡 萄 糖 转 运 （PTS 系 统 ） 过 程 中 提 供 能 量 而 转 变 成 丙 酮 酸 被 消 耗 。 基 因 ppsA 是 PEP 合 成 的 关 键 酶 基 因 ，利 用 IPTG 诱 导 表 达 调 控 系 统 ，调 控 表 达 基 因 ppsA， 可 以 提 高 PEP 的 合 成 量 。 通 过 破 坏 aroE 基 因， 切断了 3-脱氢莽草酸转化为莽草酸的反应，使 3-脱氢莽草酸累积，其产量可以作为考察指标。 在 增 加 基 因 tktA 拷 贝 数 的 同 时 ，当 IPTG 的 浓 度 为 12 mg/L、PEP 合 成 酶 活 力 增 加 为 原 来 的 7 倍 时 ，3-脱 氢 莽 草 酸 产 量 上 升 到 69 g/L， 途 径 总 产 率 为 51％ （mol / mol），比 未 增 加 拷 贝 前 产 量 增 加 17g/L， 但 副 产物 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸，3-脱氢圭尼酸，没食 子 酸 等 也 有 合 成 ； 当 IPTG 浓 度 为 48 mg/L、PEP 合 成 酶 活 力 增 加 为 原 来 的 15 倍 时 ，3-脱 氢 莽 草 酸 产 量 为 58 g/L， 产 率 为 29%（mol DHS / mol glucose）。 出 现 这 种 现 象 的 原 因 可 能 是 PEP 合 成 酶 的 表 达 量 到达了细胞生化反应产能能力的临界状态所以降 低 了 丙 酮 酸 的 可 利 用 率[9]。
图 2 莽草酸生物合成途径
经过一系列酶促反应合成莽草酸， 最终生成酪氨 酸、色氨酸、苯丙氨酸 3 种芳香族氨基酸。 该途径中 有 3 个酶对莽草酸产量有重要影响：（1）3-脱氧-阿 拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合 成酶 ， 大肠杆菌中存在 3 种该酶的同工酶，且分别受终端产物 3 种氨基酸的 反 馈 抑 制 ，限 制 了 底 物 流 入 该 途 径 合 成 莽 草 酸 ； （2） 脱氢圭尼酸合成酶， 该酶催化 3-脱氧-阿拉伯庚酮 糖酸-7-磷酸转化，当大量 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成后，该酶不能及时将上游产物转化为 3脱氢圭尼酸而使其发生去磷酸化，降低了莽草酸的 产 量 ；（3）莽 草 酸 脱 氢 酶 ，该 酶 将 3-脱 氢 莽 草 酸 还 原为莽草酸，同时受到莽草酸的反馈抑制。
3 莽草酸合成过程中底物利用率的提高
上述工程菌的应用使莽草酸合成途径得到了 改良， 由于底物赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙 酮 酸能够有效的转变为产物，莽草酸产量得到了大幅 提升。 因此，进一步提高底物的流入量有可能促进 莽草酸产量达到进一步提高。 3.1 过量表达 tktA 基因增加赤藓糖-4-磷酸的合成
关键词： 莽草酸 生物合成途径 遗传改造 工程菌
Regulation of Shikimic Acid Biosynthesis Pathway
Wang Hua Cui Zhifeng
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032）
·综 述 与 专 论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2009 年第 3 期
莽草酸生物合成途径的调控
汪华 崔志峰
（浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310032）
摘 要： 莽草酸是合成生物碱等许多其它物质的前体。近年来，莽草酸作为临床上惟一有效的抗禽流感药物— —— 达啡的原料而倍受关注。简述了莽草酸生物合成的途径，着重从基因工程角度分析了莽草酸合成过程中的关键酶及其对 莽草酸产量的影响，旨在为研究和开发微生物工程菌生产莽草酸提供参考。
收 稿 日 期 ：2008-09-01 作 者 简 介 ：汪 华 （1984-）， 男 ，硕 士 研 究 生 ，研 究 方 向 ：生 物 化 工 ；E-mail ：fanye000@126.com 通 讯 作 者 ：崔 志 峰 （1956-）， 男 ，博 士 ，副 教 授 ；Tel ：0571-88320741 ，E-mail ：zfcui@zjut.edu.cn
Key words： Shikimic acid Biosynthesis pathway Genetic improvement Genetically engineering bacterium
莽 草 酸 （shikimic acid，SA），化 学 名 为 3，4，5-三 羟基-1-环己烯-1-羧酸，其结构式，如图 1。 它是合 成许多生物碱、芳香氨基酸、吲哚衍生物与手性药 物（如抗病毒药）的前体，其自身具有抗炎、镇痛作 用，并可能通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板 聚 集 以 及 凝 血 系 统 而 发 挥 抗 血 栓 形 成 的 作 用[1]。 此 外，莽草酸是合成目前在临床上惟一一种有效抗禽 流感药物-磷酸奥斯米韦（商品名为哒啡）的合成原 料 [2] 。