发酵工程实验 讲义 2015
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制作甘油浓度的标准曲线 1. 用蒸馏水稀释甘油标准液至0.04 g/l待用，在一96孔板中取若干孔，分别加入 0,5,10,15,20,25 μl稀释的甘油标准液，然后用蒸馏水补足各孔至25 μl。
2. 再在各孔中加入25 µl 高碘酸钠溶液，迅速震荡混匀。
3. 混匀后，室温静置10 min，期间震荡混匀1-2次。 4. 10 min后，各孔加入L-鼠李糖50 μl，迅速震荡混匀。
5.混匀后各孔加入Nash试剂100 μl，放入自封袋中，53℃水浴15 min。
6. 15 min后，以未加稀释的甘油标准液的孔作为空白对照，在酶标仪上测各孔A412的平 均值。 7. 以各孔的A412平均值为纵坐标，对应的甘油浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
粗滤
超滤 酒精沉淀
SDS-PAGE电泳
相关知识介绍
1. 培养基 孢子培养基、种子培养基、发酵培养基 2.种子的制备 孢子的制备，种子的制备，菌龄，接种量
3 2
4
1
茂原链霉菌生长曲线
1.调整期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期
相关知识介绍
3. 液体深层培养的几个关键点 a. 灭菌 b. 温度控制 c. 通气和搅拌
相关知识介绍
4. 四联罐介绍
3L 的发酵罐，由罐体、空压机、主机、水源组成。
本实验用的发酵罐
谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的发酵
轮枝链霉菌接种量：5～10％（v：v） 培养条件：温度，30℃；搅拌转速为200rpm；通 气量，3vvm（通气量与发酵液体积比-VVM）；培 养时间：40h左右 。 监测发酵罐的T、通气量、搅拌转速等状态，按照 一定时间取样。 测定发酵液的pH、酶活、甘油含量和生物量。
6. 根据上述酶活公式计算酶活。
EnzymeActi vity (U / ml )
注意：OD值范围控制在0.2-1.2之间，方能使用该公式
9.1965 OD 0.0055 2
酶活测定注意事项
1. 2. 3.
反应温度37℃； 反应时间10min（精确计时）； 反应时每支管振荡混匀
甘油含量的测定
发酵工程下游实验-酶的提取与纯化
1.实验目的： 对发酵产物进行纯化及浓缩，最终制得高浓度的酶液。 2.酶分离纯化总的原则： 用最少的步骤而能取得最好的纯化效果，因为增加步骤势必增加酶 的丢失。 在低温下操作（在冰浴中），减少酶的变性失活。 3.对纯化步骤评价 收率高且纯化倍数高 4.酶纯度的检测 每个纯化步骤前后必须留2ml的样品，进行最终的SDS-PAGE电泳。
一、 谷氨酰胺转胺酶发酵批报 罐批________ 接种时间____年____月_____日 放罐时间____年____月_____日 取样时间 培养时间 pH 罐温℃ 搅拌转速rpm 通气量L/min
生物量 mg/100ml
甘油含量 酶活性 U 值班签名
TG的成熟过程—（选做实验）
TG酶在发酵过程中经历pro-TG到TG的转化，其中pro-TG的 分子量在45~50KD,而TG的分子量在40KD左右。 TG酶在发酵初期，大部分以pro-TG的形式存在，随着发酵 的进行而转化成成熟的TG酶。 因此，可以检测不同发酵时间TG酶的存在形式，即不同时 间的发酵液，取40ul上清，后用10ul 的5*的蛋白loading buffer混合后，100℃煮沸5min，后-20℃保存，等取样结 束后统一进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白条带的位置跟踪TG 酶的成熟。
干燥器中冷却，后用镊子拿取，电子天平上称量，记录重量）；
3. 酶活（MTG）； 4. 甘油含量
TG酶的测定
试剂：
底物溶液：12.11 gTris，3.475 g盐酸羟胺，1.536 g还原型谷胱甘肽，5.06
gCBZ-Gln-Gly，调至pH 6.0后定容至500 ml，过滤。
终止溶液（显色溶液）：各配制3 mol/l盐酸溶液，5 %三氯化铁，12 %三氯乙 酸500 ml，三者等体积混匀后过滤。
测定未知样品甘油浓度（标准曲线甘油浓度在0-40 µg/ml之间） 1. 将样品用蒸馏水做适当倍数的稀释。 2. 在各孔中加入25 μl样品 3. 重复标曲制作中的步骤2-6的操作。 4. 根据样品稀释液A412值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的甘油浓度。 5. 根据下式计算样品的甘油浓度。 样品甘油浓度（µg/ml）=样品稀释液的甘油浓度*样品稀释倍数
发酵生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase) 。种 菌种活化
三角瓶扩大培养 发酵罐和培养基的灭菌 发酵培养基的配制 发酵罐清洗与检查 加入到发酵罐中
接种
取样 发酵罐发酵的同时，用完全相同的条件，在摇瓶中做平行对照实验。
发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存
发酵工程模块—上游实验
贾彩凤 2015.5
实验目的
进一步理解微生物生产过程的工艺原理， 熟悉生产过程。
掌握微生物发酵罐的结构和操作方法。
学习发酵过程中指标的意义及控制，对微 生物生产过程有总体的认识。
实验材料
轮枝链霉菌（Streptoverticillium mobaraense）； 菌种特性：好氧菌；以无性孢子或菌丝片断进 行繁殖；
酒精沉淀
1.有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数从而使溶液中 的蛋白质溶解度度降低，使大分子物质脱水而相互凝聚析 出。
2.用-20℃预冷的酒精沉淀，后立即冷冻离心（7000rpm 10min），后弃上清，在通风橱内吹干残余乙醇，大约需 要半个小时。
3.后用25%（占沉淀的酶液体积量）的蒸馏水洗下沉淀，测 定该沉淀液的酶活和蛋白质含量。 4.添加乙醇的过程中，注意在冰浴中进行，在磁力搅拌器上 边缓慢添加乙醇，边搅拌，50ml的乙醇在5min左右加完，
发酵罐的取样
发酵罐监测：T、搅拌转速、通气量，记录在发酵批报上 包括取样时间和取样者姓名。 100ml（150ml）的锥形瓶进行取样约20ml 发酵液的测定： pH、酶活力、菌体干重、甘油含量
注：实验需要每次做三个平行对照，即n=3，数据表示成 mean±SD 形式。
摇瓶平行实验
所有摇瓶(250ml)在发酵罐接种时进行接种（2.4ml菌种液 /30ml培养基），以发酵罐的同样条件摇床振荡培养。 发酵罐取样的同时取该组的1个摇瓶，测定相应的指标。
MTG酶的特性
1.水溶性 2.胞外酶 3.分子量4万Da左右，为球状构型 ，单聚链 ， 由331个氨基酸构成。 4.PI= 8.9
几个概念
酶活=U/ml 总酶活U=酶活（U/ml ）×体积（ ml ）
蛋白浓度=ug/ml
比酶活（U/g）=酶活/蛋白浓度×106
收率=步骤后总酶活/步骤前总酶活
纯化倍数=步骤后比酶活/步骤前比酶活
第四天：进行SDS-page电泳，检测TG酶的产生及纯化效果。
1. 配置时，量筒定量；
2. 发酵摇瓶（规格250ml），装液量30ml； 3L发酵罐 2L； 3. 发酵促进剂难溶于水且不影响pH，故先称量0.3g于摇 瓶中；
4. 甘油及K2HPO4用烧杯称量，酵母膏等用称量纸称量；
5. 发酵罐的发酵培养基另加消泡剂：0.01g/100ml。(调 整pH后再加)
TG酶的测定
发酵液酶活的检测
1.待测样品用蒸馏水稀释合适的倍数。
2. 分别取待测样品0.15 ml于试管中，准确加入1.5 ml底物溶液于各试管，振荡混合均匀，37℃水浴 10 min。
3. 加入1.5 ml终止溶液。
4. 空白管：顺序加入1.5 ml底物溶液，终止溶液1.5 ml。 5. 去除沉淀，在525 nm处以空白管为对照，测定上清液的吸收值。
酒精沉淀参数选择
有机溶剂的添加量对纯化影响大，比较不同的乙醇添加量的影 响。可选用2倍，3倍，4倍，5倍体积的乙醇。
TG酶的纯度鉴定
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用12％分离胶，5％浓缩胶，配制 0.75mm厚的胶，插15孔样品梳。 2.测定每个步骤前后的酶液，后以等体积上样，进行SDS-PAGE电 泳。 3.根据蛋白浓度取每个步骤前后的酶液，加1/4体积的5*蛋白上样 缓冲液，置于沸水浴中煮10min， 10000g，离心5min后，每孔上 样10μL，100V恒压电泳。将电泳好的凝胶用考马斯亮蓝染色 40min，显示酶蛋白的电泳全条带。
实验要求
1.小组长负责本小组的实验安排、协调。
3.注意保存好本小组的玻璃器皿，实验结束后 清点交回，打碎丢失要赔偿！
4.实验用到高压电流、蒸汽、仪器高的压力、 水压不稳定，注意安全！
甘油和蛋白含量测定注意事项
1.样品需要稀释适当倍数，比如5，20，50，100等，使其落在标曲之间。 3.发酵液测定甘油含量，酶液测定蛋白浓度需要做适当的稀释倍数。
实验安排
按照学号，每3个人一组，全班分成8个小组，每两个组负责一个发酵罐。
第一天：配发酵培养基（包括发酵罐和摇瓶），然后进行灭菌。下午4:00进行接种，培养。 取样：0h，20:00(4h). 第二天：取样：完成发酵批报。取样时间如下：8:00(16h), 12:00(20h), 16:00(24h), 20:00(28h). 第三天： 8:30(40h)下罐。同时进行菌体离心、超滤、酒精沉淀操作。完成纯化步骤的评价表。
实验操作—发酵液指标测定
1. pH：发酵罐在线测定，或者发酵液用pH计测定。 2. 生物量（DCW）：2ml离心管取2ml发酵液，4℃下 10000rpm离心3min，上清用来测定酶活，沉淀用 Tris-Hcl复溶重悬，再次离心，后重复一次操作，沉 淀烘干至恒重（离心管事先编号，在烘箱80℃烘干过夜，拿出到
超滤浓缩示意图
超滤注意事项
1. 超滤桶中加入冷冻瓶保持低温。 2. 控制超滤压力在1 bar以内，否则超滤膜容易毁坏。
1.超滤浓缩 浓缩倍数=（浓缩液+滤出液）/超滤原液 滤筒中加冰降温，测定滤出液，超滤原液和浓缩液的酶活。 2.浓缩倍数对超滤影响大，比较不同的浓缩倍数(浓缩2倍，3倍， 4倍，5倍)对超滤的影响。 3.超滤系统较大，需用0.8L的发酵液进行超滤。
发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存 粗滤 0.22um膜过滤 超滤 30000Da的膜
酒精沉淀
SDS-PAGE电泳
•注:每个步骤都要进行蛋白质浓度和酶活等的测定。
粗滤
1.用0.22um的膜过滤，去除大分子的蛋白，进行初步的纯化， 也方便下面超滤操作。 2.尽量在低温下进行，冰浴进行。
超滤
用截留分子量为30000Da的超滤膜浓缩，收集浓缩液。按滤 出液体积记录浓缩倍数。
TG酶纯化步骤评价指标
样品 发酵上清液 酶 活 总活 力 总体 积 蛋白质浓 度 比酶 活 收 率 纯化倍 数
粗滤后/（超滤前）
超滤后
乙醇沉淀后
实验报告 以小论文形式
• • • • • • • 摘要 1. 前言 2. 材料与方法 3. 结果与分析 4. 讨论 参考文献 实验结束一周内上交（6.10日前）
2. 再在各孔中加入25 µl 高碘酸钠溶液，迅速震荡混匀。
3. 混匀后，室温静置10 min，期间震荡混匀1-2次。 4. 10 min后，各孔加入L-鼠李糖50 μl，迅速震荡混匀。
5.混匀后各孔加入Nash试剂100 μl，放入自封袋中，53℃水浴15 min。
6. 15 min后，以未加稀释的甘油标准液的孔作为空白对照，在酶标仪上测各孔A412的平 均值。 7. 以各孔的A412平均值为纵坐标，对应的甘油浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
粗滤
超滤 酒精沉淀
SDS-PAGE电泳
相关知识介绍
1. 培养基 孢子培养基、种子培养基、发酵培养基 2.种子的制备 孢子的制备，种子的制备，菌龄，接种量
3 2
4
1
茂原链霉菌生长曲线
1.调整期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期
相关知识介绍
3. 液体深层培养的几个关键点 a. 灭菌 b. 温度控制 c. 通气和搅拌
相关知识介绍
4. 四联罐介绍
3L 的发酵罐，由罐体、空压机、主机、水源组成。
本实验用的发酵罐
谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的发酵
轮枝链霉菌接种量：5～10％（v：v） 培养条件：温度，30℃；搅拌转速为200rpm；通 气量，3vvm（通气量与发酵液体积比-VVM）；培 养时间：40h左右 。 监测发酵罐的T、通气量、搅拌转速等状态，按照 一定时间取样。 测定发酵液的pH、酶活、甘油含量和生物量。
6. 根据上述酶活公式计算酶活。
EnzymeActi vity (U / ml )
注意：OD值范围控制在0.2-1.2之间，方能使用该公式
9.1965 OD 0.0055 2
酶活测定注意事项
1. 2. 3.
反应温度37℃； 反应时间10min（精确计时）； 反应时每支管振荡混匀
甘油含量的测定
发酵工程下游实验-酶的提取与纯化
1.实验目的： 对发酵产物进行纯化及浓缩，最终制得高浓度的酶液。 2.酶分离纯化总的原则： 用最少的步骤而能取得最好的纯化效果，因为增加步骤势必增加酶 的丢失。 在低温下操作（在冰浴中），减少酶的变性失活。 3.对纯化步骤评价 收率高且纯化倍数高 4.酶纯度的检测 每个纯化步骤前后必须留2ml的样品，进行最终的SDS-PAGE电泳。
一、 谷氨酰胺转胺酶发酵批报 罐批________ 接种时间____年____月_____日 放罐时间____年____月_____日 取样时间 培养时间 pH 罐温℃ 搅拌转速rpm 通气量L/min
生物量 mg/100ml
甘油含量 酶活性 U 值班签名
TG的成熟过程—（选做实验）
TG酶在发酵过程中经历pro-TG到TG的转化，其中pro-TG的 分子量在45~50KD,而TG的分子量在40KD左右。 TG酶在发酵初期，大部分以pro-TG的形式存在，随着发酵 的进行而转化成成熟的TG酶。 因此，可以检测不同发酵时间TG酶的存在形式，即不同时 间的发酵液，取40ul上清，后用10ul 的5*的蛋白loading buffer混合后，100℃煮沸5min，后-20℃保存，等取样结 束后统一进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白条带的位置跟踪TG 酶的成熟。
干燥器中冷却，后用镊子拿取，电子天平上称量，记录重量）；
3. 酶活（MTG）； 4. 甘油含量
TG酶的测定
试剂：
底物溶液：12.11 gTris，3.475 g盐酸羟胺，1.536 g还原型谷胱甘肽，5.06
gCBZ-Gln-Gly，调至pH 6.0后定容至500 ml，过滤。
终止溶液（显色溶液）：各配制3 mol/l盐酸溶液，5 %三氯化铁，12 %三氯乙 酸500 ml，三者等体积混匀后过滤。
测定未知样品甘油浓度（标准曲线甘油浓度在0-40 µg/ml之间） 1. 将样品用蒸馏水做适当倍数的稀释。 2. 在各孔中加入25 μl样品 3. 重复标曲制作中的步骤2-6的操作。 4. 根据样品稀释液A412值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的甘油浓度。 5. 根据下式计算样品的甘油浓度。 样品甘油浓度（µg/ml）=样品稀释液的甘油浓度*样品稀释倍数
发酵生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase) 。种 菌种活化
三角瓶扩大培养 发酵罐和培养基的灭菌 发酵培养基的配制 发酵罐清洗与检查 加入到发酵罐中
接种
取样 发酵罐发酵的同时，用完全相同的条件，在摇瓶中做平行对照实验。
发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存
发酵工程模块—上游实验
贾彩凤 2015.5
实验目的
进一步理解微生物生产过程的工艺原理， 熟悉生产过程。
掌握微生物发酵罐的结构和操作方法。
学习发酵过程中指标的意义及控制，对微 生物生产过程有总体的认识。
实验材料
轮枝链霉菌（Streptoverticillium mobaraense）； 菌种特性：好氧菌；以无性孢子或菌丝片断进 行繁殖；
酒精沉淀
1.有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数从而使溶液中 的蛋白质溶解度度降低，使大分子物质脱水而相互凝聚析 出。
2.用-20℃预冷的酒精沉淀，后立即冷冻离心（7000rpm 10min），后弃上清，在通风橱内吹干残余乙醇，大约需 要半个小时。
3.后用25%（占沉淀的酶液体积量）的蒸馏水洗下沉淀，测 定该沉淀液的酶活和蛋白质含量。 4.添加乙醇的过程中，注意在冰浴中进行，在磁力搅拌器上 边缓慢添加乙醇，边搅拌，50ml的乙醇在5min左右加完，
发酵罐的取样
发酵罐监测：T、搅拌转速、通气量，记录在发酵批报上 包括取样时间和取样者姓名。 100ml（150ml）的锥形瓶进行取样约20ml 发酵液的测定： pH、酶活力、菌体干重、甘油含量
注：实验需要每次做三个平行对照，即n=3，数据表示成 mean±SD 形式。
摇瓶平行实验
所有摇瓶(250ml)在发酵罐接种时进行接种（2.4ml菌种液 /30ml培养基），以发酵罐的同样条件摇床振荡培养。 发酵罐取样的同时取该组的1个摇瓶，测定相应的指标。
MTG酶的特性
1.水溶性 2.胞外酶 3.分子量4万Da左右，为球状构型 ，单聚链 ， 由331个氨基酸构成。 4.PI= 8.9
几个概念
酶活=U/ml 总酶活U=酶活（U/ml ）×体积（ ml ）
蛋白浓度=ug/ml
比酶活（U/g）=酶活/蛋白浓度×106
收率=步骤后总酶活/步骤前总酶活
纯化倍数=步骤后比酶活/步骤前比酶活
第四天：进行SDS-page电泳，检测TG酶的产生及纯化效果。
1. 配置时，量筒定量；
2. 发酵摇瓶（规格250ml），装液量30ml； 3L发酵罐 2L； 3. 发酵促进剂难溶于水且不影响pH，故先称量0.3g于摇 瓶中；
4. 甘油及K2HPO4用烧杯称量，酵母膏等用称量纸称量；
5. 发酵罐的发酵培养基另加消泡剂：0.01g/100ml。(调 整pH后再加)
TG酶的测定
发酵液酶活的检测
1.待测样品用蒸馏水稀释合适的倍数。
2. 分别取待测样品0.15 ml于试管中，准确加入1.5 ml底物溶液于各试管，振荡混合均匀，37℃水浴 10 min。
3. 加入1.5 ml终止溶液。
4. 空白管：顺序加入1.5 ml底物溶液，终止溶液1.5 ml。 5. 去除沉淀，在525 nm处以空白管为对照，测定上清液的吸收值。
酒精沉淀参数选择
有机溶剂的添加量对纯化影响大，比较不同的乙醇添加量的影 响。可选用2倍，3倍，4倍，5倍体积的乙醇。
TG酶的纯度鉴定
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用12％分离胶，5％浓缩胶，配制 0.75mm厚的胶，插15孔样品梳。 2.测定每个步骤前后的酶液，后以等体积上样，进行SDS-PAGE电 泳。 3.根据蛋白浓度取每个步骤前后的酶液，加1/4体积的5*蛋白上样 缓冲液，置于沸水浴中煮10min， 10000g，离心5min后，每孔上 样10μL，100V恒压电泳。将电泳好的凝胶用考马斯亮蓝染色 40min，显示酶蛋白的电泳全条带。
实验要求
1.小组长负责本小组的实验安排、协调。
3.注意保存好本小组的玻璃器皿，实验结束后 清点交回，打碎丢失要赔偿！
4.实验用到高压电流、蒸汽、仪器高的压力、 水压不稳定，注意安全！
甘油和蛋白含量测定注意事项
1.样品需要稀释适当倍数，比如5，20，50，100等，使其落在标曲之间。 3.发酵液测定甘油含量，酶液测定蛋白浓度需要做适当的稀释倍数。
实验安排
按照学号，每3个人一组，全班分成8个小组，每两个组负责一个发酵罐。
第一天：配发酵培养基（包括发酵罐和摇瓶），然后进行灭菌。下午4:00进行接种，培养。 取样：0h，20:00(4h). 第二天：取样：完成发酵批报。取样时间如下：8:00(16h), 12:00(20h), 16:00(24h), 20:00(28h). 第三天： 8:30(40h)下罐。同时进行菌体离心、超滤、酒精沉淀操作。完成纯化步骤的评价表。
实验操作—发酵液指标测定
1. pH：发酵罐在线测定，或者发酵液用pH计测定。 2. 生物量（DCW）：2ml离心管取2ml发酵液，4℃下 10000rpm离心3min，上清用来测定酶活，沉淀用 Tris-Hcl复溶重悬，再次离心，后重复一次操作，沉 淀烘干至恒重（离心管事先编号，在烘箱80℃烘干过夜，拿出到
超滤浓缩示意图
超滤注意事项
1. 超滤桶中加入冷冻瓶保持低温。 2. 控制超滤压力在1 bar以内，否则超滤膜容易毁坏。
1.超滤浓缩 浓缩倍数=（浓缩液+滤出液）/超滤原液 滤筒中加冰降温，测定滤出液，超滤原液和浓缩液的酶活。 2.浓缩倍数对超滤影响大，比较不同的浓缩倍数(浓缩2倍，3倍， 4倍，5倍)对超滤的影响。 3.超滤系统较大，需用0.8L的发酵液进行超滤。
发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存 粗滤 0.22um膜过滤 超滤 30000Da的膜
酒精沉淀
SDS-PAGE电泳
•注:每个步骤都要进行蛋白质浓度和酶活等的测定。
粗滤
1.用0.22um的膜过滤，去除大分子的蛋白，进行初步的纯化， 也方便下面超滤操作。 2.尽量在低温下进行，冰浴进行。
超滤
用截留分子量为30000Da的超滤膜浓缩，收集浓缩液。按滤 出液体积记录浓缩倍数。
TG酶纯化步骤评价指标
样品 发酵上清液 酶 活 总活 力 总体 积 蛋白质浓 度 比酶 活 收 率 纯化倍 数
粗滤后/（超滤前）
超滤后
乙醇沉淀后
实验报告 以小论文形式
• • • • • • • 摘要 1. 前言 2. 材料与方法 3. 结果与分析 4. 讨论 参考文献 实验结束一周内上交（6.10日前）