病毒感染的实验室诊断优秀课件

鸡胚接种
卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜
观察囊膜病变 血凝试验 血凝抑制试验
（二）病毒的分离
• 组织培养 • 鸡胚培养 • 动物接种
1.组织培养
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的 条件下使其生长繁殖的一种技术。
组织培养的类型
（1）组织块培养
（2）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒；人胚肠－肠道病 毒
（5）红细胞吸附及吸附抑制试验
受感染的宿主细胞膜含 病毒抗原（血凝素），可吸附 鸡、豚鼠或猴红细胞
如果在培养瓶中加入相应 的血凝素抗血清，则不出现红 细胞吸附现象，即红细胞吸附 抑制试验阳性
（6）血凝及血凝抑制试验
含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的 红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制， 称为血凝抑制试验，可用于分型。
病毒感染的实验室 诊断
病毒感染的实验诊断方法
➢病原学诊断
➢病毒分离培养 ➢显微镜检查 ➢抗原检测 ➢核酸检测
➢血清学诊断
➢ 抗体检测 IgM、IgG
一、标本采集与运送
（一）标本采集 ➢采集时间：尽早采集（越早越好） ➢标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择
（二）标本的运送与保存
1.低温送检
1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物
中和试验的常用方法：
•固定V.，稀释血清，测定抗体效价 （常用） • 固定血清，稀释V.，求中和指数
中和试验的优缺点
• 特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。 • 既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。 • 检测IgG，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。
• 4℃可保存数小时 •-70℃可长期保存 • -10 ～ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 • 对冷冻标本应避免反复冻融
2.保湿送检
• 50%甘油盐水保存送检 • 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明
胶或牛血清白蛋白的Hank’s液
3.无菌送检
巨细胞病毒胞核内 包涵体
2. 电镜及免疫电镜检查 直接检查标本中的病毒颗粒，快速， 可确诊。但敏感性低（＞106/ml） 免疫电镜敏感性高，但只能用于已知 病毒的检测）
病毒的理化性质测定
主要用于新发现病毒的鉴定 （1）病毒的大小及形态 电镜直接观察 （2）核酸类型
5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）能抑制DNA复制，而不抑 制RNA病毒。 （3）乙醚敏感试验
有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性 （4）耐酸试验
肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸， 在pH3的环境下被灭活
病毒的血清学鉴定
• 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等
三、病毒的血清学诊断
单份血清IgM测定 早期诊断 双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义
病毒血清学试验常用方法
（一）中和试验
原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。 V.＋Ab → 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒。 中和试验的必要条件：
用途
• 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清
（三）病毒的鉴定
病毒的初步鉴定
• 动物感染范围及潜伏期 • 对鸡胚的敏感性 • 在细胞培养中的表现 • 理化性质的测定
最后鉴定
• 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制
试验等 分离的新病毒，必须进行系统的鉴定
病毒在细胞培养中的表现
（1）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红
• 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 • 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素
二、病毒的分离与鉴定Leabharlann Baidu
（一）病毒分离和鉴定的一般程序
标本采集
标本处理后接种
动物接种
观察发病
抗原检测 抗体检测 病理检查
组织培养
CPE EM
包涵体 空斑试验 红细胞吸附 中和试验
（3）细胞培养 最常用
– 原代和次代细胞培养 – 二倍体细胞培养 – 传代细胞培养
原代和次代培养细胞
动物新鲜组织（人胚肾等）→胰酶消化→营养液培养→ 单层细胞（原代细胞）
原代细胞→胰酶消化→转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2～3代。
• 二倍体细胞株 原代细胞反复传代（50～70代）仍保持二
绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对 动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。
接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：
• 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 • 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 • 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 • 流感病毒 鼻腔滴种
（二）补体结合试验
• 检测IgM，常用于早期诊断。 • 不需活细胞，比中和试验简单，省时。
（三）IF及ELISA
• 方法简单、快速、敏感性高。
四、病毒感染的快速诊断
（一）病毒的形态学检查
1.光学显微镜检查 病变组织中找包涵体。
简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形 成包涵体
狂犬病毒胞浆内包 涵体（内基小提）
倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。
• 传代细胞系 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在
体外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用 于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。
2. 鸡胚培养
常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养
接种途径及方法
38～39℃
新鲜受精卵
7～13d
卵黄囊接种 羊膜腔接种 接种病毒 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种
• 空斑（plaque）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由
病毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒 感染 所致，利用空斑可纯化病毒。
• 不同种类病毒形成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定
病毒。
（4） 干扰现象
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种 病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。
（2）细胞病变效应（cytopathic effect ，CPE）
• 病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发 生不同程度改变，这种由病毒增殖引起 的细胞形态变化，称为细胞病变效应。
• 细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核 浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。
• 某些病毒感染细胞后不出现CPE
（3）空斑现象