6-传六孔板、活力测定、细胞计数
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• 3. 凳子收于超净台下，收捡中台、边台和地面垃圾于垃圾桶； • 4. 值日完毕离开时，将室内和室外垃圾袋带走。
• 用泡在新洁尔灭消毒液中的毛巾擦超净台面
• 将用过的瓶子、吸管、废液缸、牛皮纸、绳子放在篮子中拿到对应的普通教室，按照指定位置分类放好。其中瓶 子、瓶盖和吸管（镊子取出棉球）冲洗后泡在对应的盆里，废液缸冲洗后倒扣于对应篮筐里，牛皮纸折叠一起， 用绳子包扎好放置于对应箱子里，绳子整理成一缕放于对应篮筐里。
• 值日生需做： • 1. 待各组均完成实验后，检查各超净台内灯和风机是否已关闭、该清出的物品是否已清出、不该移出的是否有缺 漏、酒精灯是否需要补充酒精（少于容积的3/4需补）；
• 2.收捡本组大储槽和各小组小储槽于室内纸箱或者边台，摆放下一组实验用品：下一组大储槽摆在室内中台，各 组超净台内摆放： 6孔板一个，盖玻片2-3包，吸管筒两个，废液缸一个，下一组的小储槽；
着色，因而能鉴定细胞死活。常用的染料有台盼蓝（又名曲
利本蓝、锥蓝、Trypan blue）、伊红丫、苯胺黑等。
五、乳鼠原代肺细胞活力测定
载玻片上滴加一滴细胞悬液
再滴加一滴台盼蓝染液，轻轻混 匀
透明，活细胞 蓝色，死细胞
3min内在显微镜下数10个视野
计算活细胞率
活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100%
请按小组号对应的超净台号坐（两侧对坐）
动物细胞培养技术
—传代、活力测定与细胞计数
细胞生物学教研室 20源自文库7
一、细胞传代
• 原代培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则 会因细胞密度过大，或生存空间不足、营养不够导致细 胞衰老、停止生长甚至死亡。细胞的再培养，即将原代 培养瓶内的细胞分离、稀释、接种到新的培养瓶内继续 扩大培养。 • 首次传代时，细胞接种数量要多，使细胞尽快适应新环 境，有利于细胞的生存和增殖。通常，原代细胞按1:2 分种传代。
六、细胞计数
滴加一滴细胞悬液
N1
N2
滴加一滴细胞悬液
N3 四个格子平均数
N4
稀释倍数
数N1-4格， 压边界的只数两条边
计算：10000 *1*（N1+N2+N3+N4）/4=___________个/ml 4*4格，0.1mm*1mm=0.1mm3 计数板用后用酒精棉球擦拭干净
七、实验后清理台面
二、制作细胞爬片
• 盖玻片细胞培养方法主要用于细胞免疫组化片 的显微摄影和扫描电镜等研究。我们用盖玻片 细胞培养方法制作细胞爬片用于后续细胞染色 观察。
三、盖玻片细胞培养方法
•吸去（倒去）旧液 •加D-Hank’s液（小瓶20滴，大瓶40滴）漂洗一次，弃去 •加TE（小瓶15-20滴，大瓶25-30滴）消化3-5min •吸去TE，加双倍量全培（小瓶20-40滴，大瓶50-60滴）终止消化 •吸打至单细胞悬液，大瓶转移至一个离心管，所有小瓶转移至另一个离心管 •离心800转/min，6-8min •吸去上清，加全培（15-20滴）轻柔吹打至单细胞悬液 •在六孔板的每个孔中放入一片盖玻片，标记（用烧过的镊子夹） •将细胞悬液滴在6个盖玻片中间（约3-4滴，不能溢出） •静止5min •四个方向滴加全培（对称滴加），共加40滴
乳鼠肺组织细胞
1
2
3
4
5
6
复苏细胞 滴加全培 1
滴加细胞悬液 3-4滴
4
2
3 1-4每处轮流滴加一滴，直到40滴
四、活力测定——死、活细胞鉴别试验
• 事实上，任何培养瓶内的细胞都由死细胞和活细胞组成，从 外形上区别死、活细胞是困难的。当细胞死亡时，某些酸性 染料不能透入活细胞，但能透过变性死亡的细胞膜，使细胞
• 用泡在新洁尔灭消毒液中的毛巾擦超净台面
• 将用过的瓶子、吸管、废液缸、牛皮纸、绳子放在篮子中拿到对应的普通教室，按照指定位置分类放好。其中瓶 子、瓶盖和吸管（镊子取出棉球）冲洗后泡在对应的盆里，废液缸冲洗后倒扣于对应篮筐里，牛皮纸折叠一起， 用绳子包扎好放置于对应箱子里，绳子整理成一缕放于对应篮筐里。
• 值日生需做： • 1. 待各组均完成实验后，检查各超净台内灯和风机是否已关闭、该清出的物品是否已清出、不该移出的是否有缺 漏、酒精灯是否需要补充酒精（少于容积的3/4需补）；
• 2.收捡本组大储槽和各小组小储槽于室内纸箱或者边台，摆放下一组实验用品：下一组大储槽摆在室内中台，各 组超净台内摆放： 6孔板一个，盖玻片2-3包，吸管筒两个，废液缸一个，下一组的小储槽；
着色，因而能鉴定细胞死活。常用的染料有台盼蓝（又名曲
利本蓝、锥蓝、Trypan blue）、伊红丫、苯胺黑等。
五、乳鼠原代肺细胞活力测定
载玻片上滴加一滴细胞悬液
再滴加一滴台盼蓝染液，轻轻混 匀
透明，活细胞 蓝色，死细胞
3min内在显微镜下数10个视野
计算活细胞率
活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100%
请按小组号对应的超净台号坐（两侧对坐）
动物细胞培养技术
—传代、活力测定与细胞计数
细胞生物学教研室 20源自文库7
一、细胞传代
• 原代培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则 会因细胞密度过大，或生存空间不足、营养不够导致细 胞衰老、停止生长甚至死亡。细胞的再培养，即将原代 培养瓶内的细胞分离、稀释、接种到新的培养瓶内继续 扩大培养。 • 首次传代时，细胞接种数量要多，使细胞尽快适应新环 境，有利于细胞的生存和增殖。通常，原代细胞按1:2 分种传代。
六、细胞计数
滴加一滴细胞悬液
N1
N2
滴加一滴细胞悬液
N3 四个格子平均数
N4
稀释倍数
数N1-4格， 压边界的只数两条边
计算：10000 *1*（N1+N2+N3+N4）/4=___________个/ml 4*4格，0.1mm*1mm=0.1mm3 计数板用后用酒精棉球擦拭干净
七、实验后清理台面
二、制作细胞爬片
• 盖玻片细胞培养方法主要用于细胞免疫组化片 的显微摄影和扫描电镜等研究。我们用盖玻片 细胞培养方法制作细胞爬片用于后续细胞染色 观察。
三、盖玻片细胞培养方法
•吸去（倒去）旧液 •加D-Hank’s液（小瓶20滴，大瓶40滴）漂洗一次，弃去 •加TE（小瓶15-20滴，大瓶25-30滴）消化3-5min •吸去TE，加双倍量全培（小瓶20-40滴，大瓶50-60滴）终止消化 •吸打至单细胞悬液，大瓶转移至一个离心管，所有小瓶转移至另一个离心管 •离心800转/min，6-8min •吸去上清，加全培（15-20滴）轻柔吹打至单细胞悬液 •在六孔板的每个孔中放入一片盖玻片，标记（用烧过的镊子夹） •将细胞悬液滴在6个盖玻片中间（约3-4滴，不能溢出） •静止5min •四个方向滴加全培（对称滴加），共加40滴
乳鼠肺组织细胞
1
2
3
4
5
6
复苏细胞 滴加全培 1
滴加细胞悬液 3-4滴
4
2
3 1-4每处轮流滴加一滴，直到40滴
四、活力测定——死、活细胞鉴别试验
• 事实上，任何培养瓶内的细胞都由死细胞和活细胞组成，从 外形上区别死、活细胞是困难的。当细胞死亡时，某些酸性 染料不能透入活细胞，但能透过变性死亡的细胞膜，使细胞