大豆脂肪氧合酶的提取及影响酶活因素的研究

大豆脂肪氧合酶的提取及影响酶活因素的研究

CAI K

蔡 琨,方 云*,夏咏梅,石玉刚,徐一铭

(江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214036)

摘 要: 试验了从低温脱脂大豆粉中提取脂肪氧合酶(LOX)的几种方法,研究了其部分酶学性质。结果表

明,直接用水浸提得到的粗酶液的总酶活最高,每10g 豆粕达到6.71 107U,酶比活为8.61 105U/mL 粗酶

液。经盐析法或共沉淀法提纯后,总酶活的损失达55%~60%。经碱溶-酸沉-二次盐析得到的LOX 的酶比

活最高,达到9.42 107U/g 酶粉。游离LOX 的稳定性较差,室温下放置7d 后酶活下降79%。p H 值7~9为

LOX 的最佳作用范围,在pH 值9时酶活性最高。外加无机盐、糖类、多元醇或有机电解质均可以提高酶的储存稳定性和热稳定性,室温下乙二胺四乙酸二钠、草酸钠、乙酸钠及氯化钙对LOX 活性均有较好的稳定作用。

添加质量分数为1%乙二胺四乙酸二钠的酶液在42d 后酶活仍保持原来的80%左右,经50 热处理60min

后酶活仅损失6%。

关键词: 大豆脂肪氧合酶;提取;酶活

中图分类号:TQ91;Q814.2 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2004)02-0052-05

EXTRACTION OF SOYBEAN LIPOXYGENASE AND FACTORS

AFFECTING ITS ENZYME ACTIVITY

CAI Kun,FANG Yun,XI A Yong mei,SHI Yu gang,XU Yi ming

(School o f Chemical and Material Engineering,Southern Yangtze University ,Wuxi 214036,China)

Abstract:Lipoxygenase(LOX)can catalyze oxygenation of the(Z,Z) 1,4 pen tadiene moiety of polyunsaturated fatty acids

in to enantiomeric hydroperoxide fatty acids with(Z,E) conjugated diene moiety.In this paper,several methods were used for

extractin g LOX from defatted soybean powder,and LOX activity was measured.Experi ment results show that the total enzyme

activity 6.71 107U/10g (defatted soybean flour)obtained by water leachin g is the highest wi th corresponding specific en

zyme activi ty 8.61 105U/mL(enzyme preparation).The loss of enzyme activity is more than 1/2after two salting out steps

or coprecipitation process.Specific activity of LOX 9.42 107U /g (powdered enzyme)ob tained by alkali dissolving and

acid leaching followed by two salting out steps is the highes t of all.Free LOX loses 79%of i ts activi ty sharply at room tem

perature after 7days,indicating that low storage temperatures to maintain high enzyme activity is p referred.At p H value 9,

LOX exhi bits the highest enzyme activity.Addi tion of some sal ts,sugar,polyol or organic electrolytes,especially EDTA Na 2

can increase the storage stability and thermostability of LOX.B y addition of 1%(mass ratio)EDTA Na 2,the acti vity of LOX

was kept 80%of the original after 42day,and only 6%activity was lost by heat treatment at 50 for 60min.

Key words:soybean lipoxygenase;extraction;enzyme activity

收稿日期:2003-09-26

作者简介:蔡琨(1977-),女,上海人,博士生,主要从事酶催化方面的研究。

*通讯联系人;E mail:fangyunzhou@

第24卷第2期

2004年6月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest Products Vol.24No.2

June 2004

脂肪氧合酶(lipoxygenase,EC1.13.11.12)属氧化还原酶,通称脂氧酶(LOX)。LOX 中含有非血红素铁,专一催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸,通过对其分子加氧,形成过氧化氢衍生物,是非常重要的药物合成和化学合成的中间体[1~3]。LOX 广泛存在于植物界中,特别是从人类大量食用的大豆中提取的LOX 活性高于其它植物来源。1947年Theorell 首次从大豆中获得LOX 结晶。大豆中蛋白含量为40%左右,LOX 是大豆中活性最高的酶。成熟的大豆种子中LOX 含量很高,约占种子蛋白含量的1%~2%。许多研究结果认为脂肪氧合酶在植物生理,如植物萌发、生长、发育、衰老和抗性等物质转化中起某种重要调节作用,会影响植物脂肪在萌发期的氧化,脂肪过氧化形成乙烯影响植物叶片衰老,脂肪氧化影响种子的衰老、死亡、果蔬催熟和脱落,可以运用于植物抗病、抗虫和伤害反应中。LOX 可以从低温脱脂豆粕中提取,成本不高。用水或缓冲液浸提脱脂豆粕即可得到粗LOX 酶液,进一步分离提纯的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法、双相分离法等[4~5],但文献中较少进行彼此间的比较。作者以低温脱脂大豆粉为原料,采用水浸提、二次盐析、聚乙二醇(PEG)共沉淀等方法提取LOX,并对LOX 活性进行测定和比较,以便综合评价提取方法的优劣。同时研究了影响LOX 活性的因素和化学微环境影响,为保存和合理利用LOX 提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆,东北产;Tween 20,化学纯;亚油酸,生化试剂;其它化学试剂或溶剂均为分析纯。752型紫外光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂;PHS -3B 精密pH 计,上海雷磁仪器厂;LD4-2型离心机,北京医用离心机厂;81-2型恒温磁力搅拌器,上海司乐仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 LOX 的提取 大豆经粉碎后再经石油醚多次浸提得到脱脂大豆粉。每批次10g 脱脂大豆粉为原料,料液比为1 10(质量 体积),按下述5种方法提取LOX:(A)水浸提法:加水搅拌50min,4000r/min 条件下离心20min,上清液即为粗酶液。(B)酸提-盐析法:加水并用1mol/L 盐酸调pH 值至4.5,搅拌50min,过滤;滤液中加入固体硫酸铵至40%饱和,离心分离20min,弃去残渣;上清液中加入固体硫酸铵至60%饱和,离心分离20min,沉淀用pH 值9.0的0.2mol/L 的硼酸盐缓冲液溶解得到酶液。(C)缓冲液提-盐析法:加pH 值4.5的乙酸-乙酸盐缓冲液,搅拌50min,其余步骤同(B)。(D)碱溶-酸提-盐析法:加水并用1mol/L 氢氧化钠调pH 值至9.0,搅拌30min,离心20min,弃去沉淀;上清液用1mol/L 盐酸调pH 值至4.5,继续搅拌,其余步骤同(B)。(E)共沉淀法:加水并用1mol/L 盐酸调pH 值至4.5,搅拌50min,过滤;滤液中加入50%的PEG -6000至PEG 浓度达30%,继续搅拌40min,离心分离20min,用pH 值9.0的0.2mol/L 的硼酸盐缓冲液溶解沉淀,滤去不溶物得到酶液。

1.2.2 酶活测定 25 、pH 值9.0下,以亚油酸为底物的3mL 反应体系在234nm 处每分钟增加0.001吸光度值定义为一个酶活单位。将0.25mL Tween 20分散于10mL pH 值9.0的0.2mol/L 的硼酸盐缓冲液中,摇动下逐滴加入0.27mL 亚油酸,充分混合,加入1mol/L 氢氧化钠溶液使体系澄清,调pH 值至9.0,然后用上述缓冲液稀释到500mL 作为底物。取0.2mL 酶液(已稀释一定倍数)移入1.5mL 的底物溶液中,混匀后于25 水浴中恒温3min,用5mL 无水乙醇终止反应,然后加入5mL 蒸馏水,混匀后测定反应液在234nm 处的吸光度。空白样为0.2mL 酶液中加5mL 无水乙醇,再加1.5mL 底物溶液,于25 恒温3min,然后加入5mL 蒸馏水。以上方法遵循文献报道[6~7]

的基本步骤,并根据实际情况对具体条件加以修正,实验选用的酶液稀释倍数、酶和底物的加量均经多次实验确证。2 实验结果与讨论

2.1 LOX 的提取

盐析法是比较古老的方法,但目前仍广泛采用,它根据酶和杂蛋白在高浓度盐溶液中的溶解度差别进行分离纯化。最常用的盐是硫酸铵。二次盐析法是用较低盐浓度除去杂蛋白,再用较高盐浓度进行第2期蔡 琨,等:大豆脂肪氧合酶的提取及影响酶活因素的研究53