实验4 细胞融合.ppt

杂交瘤技术基本过程示意图
HAT选择性培养
HAT分别代表次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤 （aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidinFra Baidu bibliotek, T）三 种物质。 细胞的DNA生物合成有两条途径：
Choice of animal
The mouse is usually the animal of choice. Suitable
实验四
B 淋巴细胞杂交
杂交的目的----- 制备单克隆抗体
杂交瘤技术的基本原理
具有分泌功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细 胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的 骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞， 这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）。
※：该细胞的特点： 1、具有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能； 2、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤 细胞生产单克隆抗体。
细胞的融合：
1、取 PEG溶液1.0ml 缓慢加入混合细胞中, 边加边搅拌；
2、静止1分钟； 3、加HAT培养基4ml；
4、取融合细胞悬液1ml,滴加在96孔培养板中，每孔1滴（约50μl）； 5、显微镜下观察融合细胞的状态。
实验目的：
1、了解细胞杂交及单抗制备的基本原理； 2、掌握细胞融合的基本操作。
免疫脾细胞的制备 处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置 于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水 的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞 悬液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓 瘤细胞SP2/0（ 5×105细胞）混合，离心后弃上清。
※ 1、骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为1:10 2、一个脾脏可获约108个细胞
※ 实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的 剪刀、镊子、试管及培养板等冲洗干净，放回原 处，谢谢合作！
are suitable for fusion, are of BALB/C origin, 6-8 week,
female mouse is usually used
.
Choice of myeloma cell
1. NS-1, has been very widely used for hybridoma production. When cultured alone, it synthesizes κ light chains.
2. X63 and Sp2/0 are the current lines for fusion . Sp2/0 hybridoma appear to be somewhat more Sensitive than NS-1 to environmental conditions.
二、细胞抗原
1wk
细胞数量8×106个/只，洗涤三遍，用0.3~0.4ml的生理
盐水重新悬浮，腹腔注射；
3wk
细胞数量6×106个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上；
5wk
细胞数量5×106个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上；
加强
融合前的4~5天 细胞数量3×106 个/只，加强免疫。
在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿 瘤而死亡。故用丝裂霉素处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖 以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经丝裂霉素 处理，因4~5天后即进行融合。
mouse myeloma cell lines are widely available, and
grown of hybridomas in mice is usually no problem. All
of the currently available mouse myeloma lines, which