05 酶学性质表征

V
初 速 度 v
a
c b
混合级反应
0 [S ]
底物浓度对反应速度的影响
当底物浓度高达一定程度时，达到最大反应速度
V
初 速 度 v
a
c b
零级反应
0 [S ]
底物浓度对反应速度的影响
3.3 稳态学说
E
酶
+S
底物
k1 k-1
ES k2 中间产物k-2
E+P
酶 产物
稳态时，复合物的生成速率和分解速率相等
速 度
b
速率为最大速率一
v
1/2V max
半时底物浓度。
a
0
Km
[S ]
图5-14 底物浓度对酶促反应速度的影响
k������������������
=
������������������������ [������]
������������������������ ������������
酶的转化数：在单位时间内 每一活性中心或每分子酶所 能转换的底物分子数
1903年，蔗糖酶水解蔗糖
V
初
c
速
b
度
vaຫໍສະໝຸດ 酶促反应速度曲线0 [S ]
底物浓度对反应速度的影响
3.2酶-底物中间复合物学说（单底物
一定酶浓度）
中间复合物
当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度成正比
V
初
c
速
b
度
v
a
一级反应
0 [S ]
底物浓度对反应速度的影响
随着底物浓度增加，反应速度不再成比例加速
-1 0
1
Km
[S]
图5-15 双倒数作图法
1 Km 1
1
=
+
V Vmax [S] Vmax
小结
• 掌握表征参数的测定方法
—最适温度 —最适pH —温度稳定性 —pH稳定性 —金属离子 —底物谱 —动力学参数
催化效率
ST
0.0005
0.0004
0.0003
0.0002
0.0001
0.0000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
3.5 米氏常数的测定
V max[S ] V=
K m+ [S]
取倒数
1 Km 1
1
V = Vmax [S] + Vmax
3.5 米氏常数的测定
1
v
斜率=
Km Vmax
1 Vmax
1.酶促反应的影响因素
• 酶促反应速率最大时的环境温度称为酶促反应 的最适温度（optimum temperature）。
1.酶促反应的影响因素
• 酶催化活性最大时环境的pH称为酶促反应的最 适pH( optimum pH)。
• 各种酶的最适pH不同。
1.酶促反应的影响因素
• 凡是能提高酶活性加速酶促反应的物质都称为 激活剂（activator）。
3.4米氏方程
• 米氏方程（Michaelis-Menten方程）
V max[S ] V=
K m+ [S]
Vmax 为最大反应速率（maximum velocity ） [S]为底物浓度 Km 为米氏常数（Michaelis constant） V 为不同[S]时的反应速率
������m
=
������−1 + ������1
2.1 酶的纯化
• 酶分离纯化方法
—根据分子大小建立的分离 纯化方法 —根据溶解度建立的分离纯 化方法 —根据电荷性质建立的分离 纯化方法 —根据亲和作用建立的分离 纯化方法 —根据稳定性差异建立的分 离纯化方法
2.2酶的表征
• 表征参数
—最适温度 —最适pH —温度稳定性 —pH稳定性 —金属离子 —底物谱 —动力学参数
• 使酶活力下降，但不引起酶蛋白变性的作用称 为抑制作用。能引起抑制作用的物质叫做酶的 抑制剂。
• 无机离子 金属离子：K+ Na+ Ca2+ Mg2+ Zn2+ Fe2+ 阴离子： Br- Cl- I- CN- PO34-
2.测定方法
• 最适温度/pH的测定
梯度条件下反应
2.测定方法
• 金属离子依赖的测定
梯度条件下反应
2.测定方法
• 温度/pH稳定性的测定
梯度条件下孵育 后看残余酶活
热稳定性酶
• 在高温下保温一段时间后，仍能保持一定活性的 酶
StDAPDH，孵育 1h
3.动力学参数
• Km 为米氏常数 • Vmax 为最大反应速率 • kcat为转换数
3.1底物浓度对反应速率的影响
• V-[S]曲线
酶学性质表征
产酶微生物
筛选 购买
用酶方法 获取途径
基因 酶
宏基因组 数据库 商品酶库
筛选
基因工程菌构建思路
Gene
工程菌
Enzyme
阅读目的
回忆巩固基因工程菌 的构建流程
新知识：基因工程菌 表达蛋白后，进行哪 些方面的表征？表征 之前对酶做什么处理？
1.角蛋白酶基因工程菌 的构建流程
2.角蛋白酶酶学性质表 征
Wild type kcat (s-1)
40.47
kcat/ Km
Km (mM)
(mM-1 s-
1)
98.48
0.42
7.00
0.43
21.77
R71A kcat (s-1)
40.46 3.31
kcat/ Km (mM1 s-1) 96.54
0.15
3.4 米氏方程
V max
初
c
Km值等于酶促反应
������2
• Km值是酶的特征性常数，它与酶结构，酶所催 化的底物和反应环境如温度、pH、离子强度等 有关，而与酶浓度、底物浓度无关。
• 代表了酶与底物的亲和能力
• 判断最适底物；推测天然底物；推断正逆向催 化反应效率。
3.4 米氏方程
Km (mM)
mesoDAP
pyruvic acid
0.41 16.31