实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
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实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
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实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶(PPO)活性测定及酶学性质一、实验目的
1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。
2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。
二、实验原理
马铃薯不耐储藏,在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变,使外观品质和营养价值大为降低,制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。
多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶.普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成醌,使组织形成褐变.以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此,检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,在一定的温度、pH条件下,有氧存在时,能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质,单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关,在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化,通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶
邻苯二酚(儿茶酚)+1∕2O
2——————→邻醌+H
2
O
三、试验材料、试剂及试验用品
1.材料:马铃薯块茎。
2.仪器:分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;试管;移液管;容量瓶
3.试剂:L 磷酸缓冲液(pH=);L邻苯二酚;L磷酸氢二钠;L磷酸二氢钠;10mmol/L 柠檬酸;10mmol/L抗坏血酸;10mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA);10mmol/L亚硫酸钠
四、实验方法:
1.多酚氧化酶的提取
取马铃薯块茎样品,加入预冷的磷酸缓冲液()3ml,研磨匀浆,转移到离心管中,再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵,合并提取液,在4℃下离心(8000r/min)5min,取上清液为多酚氧化酶提取液,并量取粗酶液体积。
2.多酚氧化酶活性测定
采用比色法测定。将ml邻苯二酚加入2ml磷酸缓冲液(pH)中,加入ml酶提取液,立即于波长410nm下测定吸光值,2min后再计吸光值,以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为: ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。
表1 多酚氧化酶活性测定
3.多酚氧化酶酶活的计算公式:
以每克样每分钟内A410增加为1个酶活力单位U。
△A410×酶提取液总量(ml)
酶活力(g min)=———————————————————
×反应时间(min)×样品鲜重(g)×测定时酶液用量(ml)
4 酶学特性
PH对多酚氧化酶活性的影响
室温下在试管中加入已配好的不同pH值的缓冲溶液,邻苯二酚,多酚氧化酶粗酶液mL,混匀后迅速测定吸光度,转换为多酚氧化酶的活性。以缓冲液pH值为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,作出酶活—pH曲线,以确定最适pH值。
表2 pH对多酚氧化酶活性的影响
温度对多酚氧化酶活性的影响
试管中加入pH 的磷酸盐缓冲溶液, 以邻苯二酚溶液为底物,在不同温度(常温、40、60℃的温度条件)下保温5min后,加入多酚氧化酶粗酶液,混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以温度为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,作出酶活—温度曲线,以确定最适温度。
表3 温度对多酚氧化酶活性的影响
抑制剂对多酚氧化酶活性的影响
将抑制剂抗坏血酸(VC)、柠檬酸、亚硫酸钠、EDTA分别用的磷酸盐缓冲溶液配制成10mmol/L的溶液,在室温下分别取上述抑制剂,以邻苯二酚溶液为底物,加入多酚氧化酶粗酶液,混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以抑制类型为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,绘制抑制剂对酶活影响的图形,分析抑制剂对酶活性影响。
表4抑制剂对多酚氧化酶活性的影响
五、注意事项
1、反应混合液必须现配现用,否则会因邻苯二酚自动氧化而失效;
2、在试验中加入一种酚结合剂--聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用,从而消去酶反应体系中的底物,使 PPO活性的测定更接近其真值。
3、使用分光光度计时要求动作快速、熟练。
4、加样时,先加缓冲溶液,再加底物邻苯二酚,摇匀,在测量之前最后加酶提取液。
六、思考题
1. 本试验中使用到磷酸缓冲液,请问磷酸缓冲液在本试验中的作用
2. 试分析不同温度、pH对马铃薯多酚氧化酶的影响
3. 谈谈你对多酚氧化酶活性性质的认识。
参考文献:
曹建康,姜微波,赵玉梅编着.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社,.
毛丽梅,邓红,马安德,卢晓翠。食品安全综合实习指导.科学出版社,.
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李彩霞张芬琴张喜峰赵金梅白生文