金银花中绿原酸的提取与分离
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现代分离技术实验安排
一、实验说明
1、本课程实验为一次性综合大实验，采取分班进行，每班实验必须在连续两天内完成，各组的实验安排均为周六和周日的上午8点到晚上的8点。
每次实验1个班，每个实验由两个人共同完成，即两人一组，每组一套实验仪器和一张实验台。每班的班长负责实验室的卫生和安全。
2、课程考核方法采用实验考察形式进行，每人只安排一次实验机会，过期不补，希望各位同学能够按时参加。若有冲突，学生之间可相互对调。
实验期间，应注意保持实验室台面、地面和水槽的卫生，尤其是自己的工作区域。同时应注意实验室的财产安全和自身安全，不可在实验室喧哗吵闹。
二、实验内容
题 目：金银花中绿原酸的提取与分离
学习内容：固体中有效成分的提取（索氏法）技术；
减压浓缩（旋转蒸发）技术；硅胶吸附柱层析；
硅胶吸附TLC技术；薄层色谱对产品纯度检测
金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属多种植物的干燥花蕾，它是一种“药食同源”的绿色植物，是临床常用的中药之一。具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的功能，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热、急性支气管炎、肺炎、腮腺炎、胆道感染、关节炎等，能改善放、化疗所致的白细胞降低，有“中药中的青霉素”的美誉。另外，金银花还被广泛地应用于保健品、化妆品、卷烟、食品等行业。近代研究一般认为金银花的主要生物活性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的优劣。
附：试验主要用品
1材料
金银花（为金银花花蕾和开放花的混合样品，经烘房烘干后，备用。）
2试剂
本实验所用有机、无机试剂均为分析纯。
薄层层析硅胶：GF254和硅胶G，化学纯
柱层析硅胶：硅胶G（粒度100-200目）
3主要仪器
旋转蒸发仪、电热恒温鼓风干燥箱、三用紫外仪、电子分析天平、高效液相色谱仪。
3、进入实验室后，各组同学首先按照仪器清单检查仪器的数量和完好情况。若有仪器短缺或破损等问题，请在上课后20分钟内与实验室工作人员及时联系，并要求实验人员进行补充或更换。
4、实验结束后，各组同学应对照仪器清单检查，分别洗净后交实验人员验收。如有损坏或缺少，应按规定缴纳赔偿金。因此，希望同学们爱惜仪器，认真操作。
（3）精制
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干后得绿原酸粗品，该部分再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得一化合物（E），
即为绿原酸精品。
4、检测
对B5C1和E两部分分别进行高效液相色谱分析，检测两部分的绿原酸含量。
测定条件：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，SPD-10AV紫外检测器，以乙腈－0.4%磷酸（13:87）为流动相，327nm下检测。
绿原酸结构式
三、实验方案
四、方法
1、TLC板的制备与活化
在干净的研钵内加入约6g硅胶GF254，在轻轻研磨的同时缓慢加入15ml 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液。继续研磨约10min，当体系粘稠度适宜时，即可进行铺板。
用药匙将适量糊状物均匀摊在干净干燥的载玻片上，然后用手拿住薄板的一端在台面上轻轻振动，直至薄层均匀为止。将铺好的薄板平放在水平的台面上，凉干。
具体方法：
收集液的薄层预检：在对各收集管进行TLC分析之前，为了节约薄板，可用毛细管将各收集管中的液体依次在一块薄板上并对各点样按照相应的管号一次编号，等样点上的溶剂彻底挥发干后，置于波长365nm的紫外灯下观察，有明显斑点的表明其对应接受管中含有化合物，没有斑点的表明对应管中没有化合物。然后再对有斑点的各管按照下法进行TLC分析。
将凉干后的薄板放入预先恒温到105～110℃的烘箱中活化30min。
2、提取（索氏法）
将金银花制成粗粉，称取约100g，用75%乙醇采用索氏提取器回流处理4h，其提取液减压浓缩、60℃干燥得浸膏。
3、分离
（1）粗分离
取一定量浸膏，按1∶1加入200-300目硅胶拌样，晾干。
用乙酸乙酯湿法装柱（柱型Ø8.5cm×53cm，硅胶200-300目），干法上样，柱体依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶0.1）、甲醇洗脱。流速控制在每1/10柱体积即可。分部收集，每管30ml。
（2）粗分离过程中薄层检测
粗分离过程中对柱子的洗脱情况随时进行薄层检测，展开剂为乙酸丁酯∶甲酸∶水（7∶2.5∶2.5）。从某个馏分开始有绿原酸出现（λ365nm下显兰色荧光）至几乎看不到兰色荧光，显示绿原酸已基本收集完全。结合显色剂显色，将相同流分合并，共分26个部分。其流程图：
图2金银花粗分流程图
TLC分析：用事先活化好的薄层板对每管收集液进行TLC分析，点样数视板的大小而定，每两斑点之间最小间距不Baidu Nhomakorabea于8mm，其中有一个为绿原酸对照点（注意：每个毛细管只能用于同一个样品；每个试管的点样量应相同；点样时应按管号依次进行；每个TLC分析的薄层板应依次编号）。等展开剂爬行到板层4/5～5/6高度时，取出薄层板，室温平放或平放于暖气片上，让溶剂挥发干。然后将薄板置于波长365nm下，观察和记录薄板上斑点的分布情况及其对应的Rf值。
TLC分析内容如下：
判断斑点数的多少。展开后，斑点数多表明所含化合物越多。只有一个斑点者表明对应管中可能含有纯化合物。斑点颜色越深表明所含对应化合物的量越多。
根据Rf值或斑点高度判断不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有相同斑点，表明两管含有相同的成分。
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干后得绿原酸粗品。
一、实验说明
1、本课程实验为一次性综合大实验，采取分班进行，每班实验必须在连续两天内完成，各组的实验安排均为周六和周日的上午8点到晚上的8点。
每次实验1个班，每个实验由两个人共同完成，即两人一组，每组一套实验仪器和一张实验台。每班的班长负责实验室的卫生和安全。
2、课程考核方法采用实验考察形式进行，每人只安排一次实验机会，过期不补，希望各位同学能够按时参加。若有冲突，学生之间可相互对调。
实验期间，应注意保持实验室台面、地面和水槽的卫生，尤其是自己的工作区域。同时应注意实验室的财产安全和自身安全，不可在实验室喧哗吵闹。
二、实验内容
题 目：金银花中绿原酸的提取与分离
学习内容：固体中有效成分的提取（索氏法）技术；
减压浓缩（旋转蒸发）技术；硅胶吸附柱层析；
硅胶吸附TLC技术；薄层色谱对产品纯度检测
金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属多种植物的干燥花蕾，它是一种“药食同源”的绿色植物，是临床常用的中药之一。具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的功能，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热、急性支气管炎、肺炎、腮腺炎、胆道感染、关节炎等，能改善放、化疗所致的白细胞降低，有“中药中的青霉素”的美誉。另外，金银花还被广泛地应用于保健品、化妆品、卷烟、食品等行业。近代研究一般认为金银花的主要生物活性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的优劣。
附：试验主要用品
1材料
金银花（为金银花花蕾和开放花的混合样品，经烘房烘干后，备用。）
2试剂
本实验所用有机、无机试剂均为分析纯。
薄层层析硅胶：GF254和硅胶G，化学纯
柱层析硅胶：硅胶G（粒度100-200目）
3主要仪器
旋转蒸发仪、电热恒温鼓风干燥箱、三用紫外仪、电子分析天平、高效液相色谱仪。
3、进入实验室后，各组同学首先按照仪器清单检查仪器的数量和完好情况。若有仪器短缺或破损等问题，请在上课后20分钟内与实验室工作人员及时联系，并要求实验人员进行补充或更换。
4、实验结束后，各组同学应对照仪器清单检查，分别洗净后交实验人员验收。如有损坏或缺少，应按规定缴纳赔偿金。因此，希望同学们爱惜仪器，认真操作。
（3）精制
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干后得绿原酸粗品，该部分再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得一化合物（E），
即为绿原酸精品。
4、检测
对B5C1和E两部分分别进行高效液相色谱分析，检测两部分的绿原酸含量。
测定条件：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，SPD-10AV紫外检测器，以乙腈－0.4%磷酸（13:87）为流动相，327nm下检测。
绿原酸结构式
三、实验方案
四、方法
1、TLC板的制备与活化
在干净的研钵内加入约6g硅胶GF254，在轻轻研磨的同时缓慢加入15ml 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液。继续研磨约10min，当体系粘稠度适宜时，即可进行铺板。
用药匙将适量糊状物均匀摊在干净干燥的载玻片上，然后用手拿住薄板的一端在台面上轻轻振动，直至薄层均匀为止。将铺好的薄板平放在水平的台面上，凉干。
具体方法：
收集液的薄层预检：在对各收集管进行TLC分析之前，为了节约薄板，可用毛细管将各收集管中的液体依次在一块薄板上并对各点样按照相应的管号一次编号，等样点上的溶剂彻底挥发干后，置于波长365nm的紫外灯下观察，有明显斑点的表明其对应接受管中含有化合物，没有斑点的表明对应管中没有化合物。然后再对有斑点的各管按照下法进行TLC分析。
将凉干后的薄板放入预先恒温到105～110℃的烘箱中活化30min。
2、提取（索氏法）
将金银花制成粗粉，称取约100g，用75%乙醇采用索氏提取器回流处理4h，其提取液减压浓缩、60℃干燥得浸膏。
3、分离
（1）粗分离
取一定量浸膏，按1∶1加入200-300目硅胶拌样，晾干。
用乙酸乙酯湿法装柱（柱型Ø8.5cm×53cm，硅胶200-300目），干法上样，柱体依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶0.1）、甲醇洗脱。流速控制在每1/10柱体积即可。分部收集，每管30ml。
（2）粗分离过程中薄层检测
粗分离过程中对柱子的洗脱情况随时进行薄层检测，展开剂为乙酸丁酯∶甲酸∶水（7∶2.5∶2.5）。从某个馏分开始有绿原酸出现（λ365nm下显兰色荧光）至几乎看不到兰色荧光，显示绿原酸已基本收集完全。结合显色剂显色，将相同流分合并，共分26个部分。其流程图：
图2金银花粗分流程图
TLC分析：用事先活化好的薄层板对每管收集液进行TLC分析，点样数视板的大小而定，每两斑点之间最小间距不Baidu Nhomakorabea于8mm，其中有一个为绿原酸对照点（注意：每个毛细管只能用于同一个样品；每个试管的点样量应相同；点样时应按管号依次进行；每个TLC分析的薄层板应依次编号）。等展开剂爬行到板层4/5～5/6高度时，取出薄层板，室温平放或平放于暖气片上，让溶剂挥发干。然后将薄板置于波长365nm下，观察和记录薄板上斑点的分布情况及其对应的Rf值。
TLC分析内容如下：
判断斑点数的多少。展开后，斑点数多表明所含化合物越多。只有一个斑点者表明对应管中可能含有纯化合物。斑点颜色越深表明所含对应化合物的量越多。
根据Rf值或斑点高度判断不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有相同斑点，表明两管含有相同的成分。
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干后得绿原酸粗品。