霉菌的分离纯化和鉴定

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⑵用液体培养基获得纯培养
稀释法：
方法：接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀 释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物；
特点：工作量大，是否获得纯培养依靠统计学的推测；
应用：用于不能或不易在固体上生长的菌落；
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3、培养条件
项目 类型 细菌 放线菌 霉菌和酵母菌 温度 37℃ 28℃ 28℃ 培养时间 1-2d 5-7d 5-7-14d
缺点：操作相对麻烦，热敏感菌易被烫死， 特点：简单，多用于对已有纯培养的确 缺点：由于菌落形成在琼脂住中间，观 严格厌氧菌生长受限； 认和再次分离； 察和挑取困难； 注：取样液约1ml； 缺点：无法分离得到不可培养的内生细 应用：在缺乏专业的厌氧设备的情况下 菌；此法最简便，但可能遗落部分菌株； 对严格厌氧菌进行分离和观察；
卵孢子 接合孢子 子囊孢子 厚垣孢子 节孢子 分生孢子 孢囊孢子
同一菌丝体上产生有性繁殖结构 形成有性孢子，进行有性繁殖 无性孢子、有性孢子及菌丝断片都 能发育成新的菌丝和菌丝体
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2、菌落形态
霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈绒毛状、絮状或网状。
菌体可沿培养基表面蔓延生长。 由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈现红、黄、绿、 青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。 霉菌菌落正反面颜色呈现明显差别。 液体培养时的特征： 如果是静止培养，霉菌往往在表面 上生长，液面上形成菌膜。 如果是震荡培养，菌丝有时相互缠 绕在一起形成菌丝球，菌丝球可能均匀 地悬浮在培养液中或沉于培养液底部。
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举例
霉菌在孟加拉红培养基上的典型特征
霉菌在孟加拉红培养基上典型特征 为灰色菌落，有黑色孢子。
链霉菌
甘油硝酸盐琼脂：气丝微褐色。基丝无色至淡黄色，在大部分所 用培养基内无可溶色素； 葡糖天冬素琼脂：气丝初白色，后粉褐色。基丝无色至淡褐色； 淀粉琼脂：气丝白色至微褐色带微粉色彩。基丝无色至乳脂色带 淡褐色彩； 苹果酸钙琼脂：气丝白色。基丝无色。营养琼脂：气丝少，白色。 基丝乳脂色。
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⑵常用培养基
◆细菌——牛肉膏蛋白胨培养基（肉汤培养基）pH7.2-7.4； 注意事项：
①在加入凝固剂之前调 pH值；②加酸碱要缓慢， 多搅拌；③加热杀菌后 pH值下降0.3-0.4。 ◆霉菌——马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查氏酵母膏琼脂培养基(CYA)、
◆放线菌——高氏一号培养基；
特定类群微生物的分离（定向分离）； 获取新资源（分离未知菌）； 分离“混合菌”（完成某种功能的一组菌）；
二、分离的基本原则是：
获得目的菌； 排除非目的菌；
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总思路流程
采样
1、目的菌的富集培养； 2、减少非目的菌； 3、目的菌的充分释放； 1、微生物资源的分布； 2、样品的采集：2h、4℃；
麦芽汁琼脂培养基(MEA)、甘油硝酸盐琼脂培养基(G25N)、 察氏培养基(CA)、孟加拉红培养基、豆汁培养基、其他；
孟加拉红培养基成分： 察氏培养基成分： 蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(MgSO4· 7H2O) PDA培养基成分：
0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100ml、蒸馏水1000ml、氯 硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4· 2O) 0.5g、 7H 马铃薯200g、 葡萄糖20g、琼脂 15-20g、自来水1000ml、 霉素0.1g 氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏 自然PH约6.0 上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙 水1000ml 醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min
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2、分离方法介绍
获得微生物纯培养的几种常用方法 (一)固体培养基分离方法 特点：操作简单，是常规方法；
1. 涂布平板法 2. 稀释倒平板法 3. 平板划线法 4. 稀释摇管法
缺点：易因涂布不均使某些部位菌落 不能分开，不易于计数； 方法：用接菌环沾取待分离菌或菌液在 注：取样液约0.1-0.2ml； 分离平板上划线分离； 特点：是稀释倒平板法的变通形式； 特点：菌落分离均匀，计数相对准确；
酵母菌
丝状真菌的统称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、
霉菌： 网状或絮状菌丝体的真菌（除少数外），统称为霉菌。
蕈xùn菌（大型真菌）
●分布相当广泛。 ●是各种复杂有机物的主要分解菌。其是数量最大
的纤维素、半纤维素和木质素的主要分解菌。 ●一般情况下，在潮湿的环境下易于生长，特别是 偏酸性的基质当中。培养温度28-32℃。
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斜面接种法
斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种； 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面的纯培养物 接种到斜面培养基上，称为斜面培养； 霉菌的斜面接种：适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛 霉、根霉等）。常用点接法，即点接在斜面中部偏下方； 接种室避免碰到试管壁，防止污染；超净台酒精灯附近操作，注意灼 烧试管口及棉塞； 应斜持试管呈45度角，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养 基表面，造成污染；
低等真菌特有
高等真菌特有
根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成两种类型： 无隔膜菌丝：无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核，这 是低等真菌所具有的菌丝类型； 有隔膜菌丝：有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个 细胞组成，每个细胞内有1个或多个细胞核。在隔膜上有1至多个小孔，使细胞 之间的细胞质和营养物质可以相互沟通，这是高等真菌所具有的菌丝类型；
预处理
1、培养基设计原则；
初筛
1、获得纯培养；
2、分离方法介绍； 3、培养条件；
2、选择目的菌株；
复筛
1、霉菌简介； 2、菌落形态； 3、霉菌制片观察；
形态学观察
1、真菌的系统发育谱； 2、微生物快速鉴定技术； 18SrRNA
生理生化实验 分子生物学方法
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一、微生物资源的分布及样本的采集
根据目的菌的生理特性，加入其所需要的营养物质及微量成分进 行诱导增殖，增菌；设计特定的有利于待分离菌株生长的环境。 ——为了分离铁硫杆菌，可将样品加硫磺后培养； ——为了分离分解纤维素或角蛋白等的酶产生菌，可以将样品与 高浓度的纤维素或角蛋白（适当加入其他成分）在适当温度 下保湿培养一段时间，再进行分离；
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初筛与复筛的区别：
◆
过检测得到一些较优菌株；
◆
初筛是指从大量的菌落中随机挑取进行摇瓶试验并通 复筛是指将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验
将所得目标菌接入斜面中，4℃进行短期保存。
斜面保存
验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个 最优的菌株；
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五、形态学观察 1、霉菌简介 ⑴ 真 菌
注：根据不同培养基性质等因素，培养条件有所差异，需视情况而定。
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四、复筛
将获得的单菌落接种于复筛培养基，给予一定条件进 行培养，对产物产率、性能等相关标准进行评价，即可挑 出所需要的菌株； 根据目标菌的性质进行设计： 分解淀粉 分解脂肪 透明圈 分解纤维素 耐高温低温 耐酸碱高渗透压 产糖产酶效率—发酵 抑菌效果：滤纸片法、牛津杯法
形态特征
曲霉 根霉
絮状 分生孢子 乳白色托 无 无 无 菌丝任何处可生
毛霉
青霉 犁头霉
有 圆形
有 有无 有
网状 灰褐色 分生孢子 棉絮状 灰白色 有 有 有 有 无 从假根处 匍匐枝弓背生 出 无 圆形，较大 洋梨形，较小 有 有 有 有 无 无 有
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⑷丝状真菌的生活史
菌丝
产生无性孢子 进行无性繁殖
霉菌的分离、纯化与鉴定
怎样鉴定微生物呢？
微生物鉴定主要是要回答两个问题：
一、它是不是某一种菌？
——针对性； ——规范的检测鉴定方法； ——如：致病菌检测；
二、它到底是什么菌？
——常规鉴定； ——大致的工作步骤； ——如：筛菌，潜在用途；
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分离资源微生物的基本原则
一、微生物可谓无处不在，获得什么样的微生物， 取决于分离的目的：
极端环境：
尽量存放在与采样环境相当的条件下至菌种分离；
植物和动物：
确保样品的完整性，迅速对植物切口进行消毒，并用石蜡封 住以防外来菌种入侵，用无菌装置带回；如动物粪便的采集应在动物 排便后马上收集其中间部分，避免外源污染，置于无菌袋内；
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二、样品的预处理
1、目的菌的富集培养
真菌：Smith、Alexopoulos、Ainsworth分类系统
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代表性霉菌：
①毛霉属 ②根霉属 ③曲霉属 ④青霉属 ⑤脉孢菌属 ⑥赤霉菌属
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⑶霉菌的形态结构
霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝构成。 许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。 菌丝是中空管状结构， 直径约2~10µm。
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生长在固体培养基上的霉菌菌丝可分为三部分：
①营养菌丝：深入培养基内，吸收营养物质的菌丝； ②气生菌丝：营养菌丝向空中生长的菌丝； ③繁殖菌丝：部分气生菌丝发育到一定阶段，分化 为繁殖菌丝，产生孢子。
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几种常见的霉菌形态
鉴定主要依据
菌名
菌名
形态特征 菌丝 无性孢子 匍匐枝 假根 分生孢子有无横隔 孢子囊柄 孢子囊 顶囊 囊轴 囊托 足细胞 囊领
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⑵分类
目前，真菌学仍然是微生物学的薄弱环节，还有待进一步深 入研究。在系统学方面，受到公认的分类体系不多。
真菌的类群：
接合菌纲：代表种—毛霉、根霉 子囊菌纲：代表种—酵母菌、羊肚菌 担子菌纲：代表种—鹅膏菌、伞菌 卵菌纲：代表种—异水霉属 半知菌纲：代表种—青霉属、曲霉属、假丝酵母
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3、霉菌的制片观察
⑴培养方法
①插片法 ②搭片法 ③玻璃纸法 ④印片法 ⑤小室培养
(1)开槽及接种：用无菌打孔器在凝 (1)制平板、接种 固后的平板培养基上打洞数个，并 (2)插片及培养：用无菌镊子取无菌 (1) 玻璃纸前期准备：以无菌操作用镊 ◆用镊子取洁净载玻片并微微加热， 将孢子划线接种至洞内边缘； 盖玻片，在已接种平板上以45°角斜 子将已灭菌的小块玻璃纸片铺在培养基 然后用此微热载玻片盖在长有待观 (2)搭片及培养：在接种后的洞面上 插入培养基内，插人深度约占盖玻片 表面，用无菌涂布棒将玻璃纸压平，不 察菌的平皿上，轻轻压一下； 放一无菌盖玻片，平板倒置28℃， 1/2长度。将插片平板倒置于28℃， 留气泡，每个平板可铺5-10块玻璃纸； 培养3～7d； ◆注意将载玻片垂直放下和取出， 培养3～7d； (2) 涂布菌液及培养：取0.l ml孢子悬液 (3)水封片观察：取一滴美蓝染色液 以防载玻片水平移动而破坏菌体的 (3)培养后的菌丝体生长在培养基 涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面， 置于载玻片中央，将搭片法培养皿 自然形态； 及盖片上。在缺少营养的盖片上菌丝 接种平板倒置于28℃，培养 5～7d； 中的盖玻片取出，将有菌面朝下， 稀疏, 且易产生抱子, 便于镜检。 ◆反转有印痕的载玻片微微加热固 (3)直接玻璃纸观察：于载玻片上放一 放在载玻片上，浸在染色液中，制 ◆可观察到菌体自然生长状态下的特 定，用石炭酸复红染色1min，水洗， 小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片剪下一小 成水封片，用高倍镜观察，并绘图。 征，且便于观察不同生长期的形态。 晾干； 块，移至载玻片上，并使有菌面向上， 注意不能有气泡。于显微镜下观察，先 ◆用油镜观察，并绘图。 用低倍镜观察菌的立体生长状况，再用 ◆印片法主要用于观察孢子形态、 高倍镜仔细观察。 排列及其形状等，方法简便。
土壤环境：
每年春季或旱雨季之交，一般在3-5月为佳；通常采集1040cm深处的土样；若要分离放线菌和真菌，土样应放到无菌牛皮纸袋 中，一般不放在瓶子或塑料袋中；如果要分离细菌，最好要保湿；
海洋环境及湿地：
0.5μm的滤膜过滤水样，以增加出菌率；Ekmann型采泥器或 重锤式取样器采集；样品装入无菌瓶内，不能密封，在3h内用于实验；
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三、初筛
设计选择性培养基，稀释涂布，挑选目标菌株。 1、培养基设计原则
合适的营养物质及浓度配比，如不同的C/N源；各无机盐比例适 当；合适的渗透压或水分活度；适宜的pH等；
⑴具体如下：
开发意图贯穿分离过程，使培养基“只”满足目的菌的要求， 而非目的菌不长；eg.寻找低温碱性脂肪酶产生菌 大剂量加入同类化合物；eg.酒精酵母 特殊成分；eg.维生素、氨基酸、无机盐等 真菌抑制剂：放线菌酮、制霉菌素等； 细菌抑制剂：青霉素、链霉素； 抑制剂： 萘啶酸可抑制革兰氏阴性细菌； 放线菌分离中，选用重铬酸钾做抑制剂能很好的抑 制细菌和真菌，几乎不影响放线菌的生长；
2、减少非目的菌
——若目的菌耐干燥，则可通过干燥减少非目的菌； ——若要分离高温菌，可在特定高温下震荡培养若干时间，以减 少非耐热菌的干扰； ——加入非目的菌的抑制剂；
3、目的菌的充分释放
——使目的菌与样品基质分离：加入活化剂或乳化剂；震荡及超 声波处理，DDC技术；酶法或研磨等组织破碎法；