常用细菌染色法汇总

常用细菌染色法汇总

细菌的染色是染料分子与细菌成分相结合的化学过程。细菌蛋白质是兼性电解质，pH在2～5之间。在近于中性环境中，细菌多带阴电荷，易与带阳电荷的碱性染料结合而着色，因此细菌染色，多用带阳电荷的碱性苯胺染料，如美兰、碱性复红、龙胆紫等。常用的细菌染色法有下列几种。

一、单染色法

单染色法是只用一种染料，如碱性美兰或稀释石炭酸复红将细菌染成兰色或红色，可供观察细菌的形态、大小和排列，但不能鉴别细菌。

［材料］

1.葡萄球菌或大肠杆菌18～24h液体培养物

2.美兰或石炭酸复红稀释液

3.载玻片、酒精灯、接种环、染色架、滤纸等［方法］

1.涂片用灭菌接种环取菌涂于载玻片上，薄厚均匀，直径约1cm面积。如为固体培养基上的培养菌，则应于洁净载玻片上滴1滴生理盐水，再用接种环取菌少许混于其中并混匀，涂成菲薄的菌膜。

2.干燥一般置涂片于室温中自然干燥，还可将涂膜向上，放于温箱中或于酒精灯火焰上方热空气中干燥。

3.固定一般用加热法，手持载玻片一端，迅速通过酒精灯火焰3次，目的是使菌细胞质凝固，以固定细菌的形态。

4.染色将涂片置于染色架上，滴加染液（葡萄球菌滴美兰，大肠杆菌滴石炭酸复红）以覆盖涂抹的菌膜为度，不宜过多，染色时间为1～2min。

5.水洗、干燥、镜检用自来水轻轻水洗涂片，除去染液，夹于滤纸间，吸去水

份，完全干燥后镜检。

［结果］ 葡萄球菌和大肠杆菌分别被染成兰色和红色，前者呈葡萄状排列，后者散在排列。

二、复染色法

复染色法用两种以上的染料染色，可将细菌染成不同的颜色。除可观察细菌的形态外，还能鉴别细菌，所以也称鉴别染色法。

（一）革兰染色法（Gram stain）

细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由Gram创立，故得名。革兰染色法不仅可鉴别细菌，而且可以辅助临床选择有效的治疗药物和了解细菌的致病性。常见革兰阳性菌和革兰阴性菌见表7-l。

［材料］

1.葡萄球菌和大肠杆菌18～24h培养后的混合菌液

2.革兰染色液（结晶紫染液、芦戈碘液、95％酒精、稀释石炭酸复红）

3.其他材料同单染色法

［方法］

涂片、干燥、固定按单染色法进行。染色按下列步骤进行。

1.初染滴加结晶紫染液，染lmin，水洗。

2.媒染滴加芦戈碘液，染lmin，水洗。

3.脱色放入95％酒精罐内，轻轻摇动玻片，直至不再溶下染料为止，约

30Sec，水洗。

4.复染滴加石炭酸稀释复红液，染30Sec，水洗。

5.用滤纸吸去水份，干燥后镜检。

［结果］ 革兰阳性菌染成紫色，阴性菌染成红色。

［附录］ 革兰染色原理尚未确切了解。就目前所知，决定革兰染色的主要因素有：（1）G+菌等电点（pH2～3）低于G-菌（pH4～5）。在同样条件下，G+菌带负电荷多，与带正电荷的结晶紫染料结合牢固。（2）G+菌细胞壁肽聚糖层数多，经乙醇脱水作用，肽聚糖网络结构变得更致密，染料复合物不易从细胞内漏出。而G-菌细胞壁脂类含量多，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易漏出。两种因素中以后者更重要。细菌的革兰染色结果受多种因素（菌龄、染色和脱色时间、pH等）影响，染色时应严格按正规操作，才会得到准确结果。

（二）抗酸染色法（Acid-fast stain）

分枝杆菌属中的细菌含脂质多，一般染色法不易着色，须用抗酸染色法。抗酸染色法能将细菌分为两大类，即抗酸性细菌和非抗酸性细菌。但抗酸性细菌种类较少，大多数细菌均为非抗酸性细菌，故一般仅在怀疑抗酸性细菌时用，而不作为常规检查。

［材料］

1.疑似肺结核病人清晨的喀痰

2.抗酸染色液（石炭酸复红、3％盐酸酒精、美兰染液等）

3.其他材料同单染色法

［方法］

1.涂片用洁净的牙签沾取痰中带血的痰液或干酪坏死的痰块，涂在玻片上。

2.干燥、固定同单染色法。

3.初染滴加石炭酸复红染液于涂膜上，在火焰上方加温至产生蒸气，但不得煮

沸，

如此保持5 min，切忌染液干涸，应及时补加染液，待冷却后水洗，以免玻片突然受冷而炸裂。

4.脱色将3％盐酸酒精滴于涂膜上，摇动玻片，倒掉，再加脱色液，反复2～3次至涂片无染液流下为止，水洗。

5.复染用美兰染液染lmin，水洗。

6.待干，镜检。

［结果］

结核杆菌等抗酸性细菌染成红色，非抗酸性细菌（非结核菌）染成兰色。必须在整个涂片找不到一个结核菌时，才能报告为阴性。必要时可将痰液集菌后涂片，以提高检出率。

三、特殊染色法

细菌的某些结构，如荚膜、芽胞、鞭毛、胞质中异染颗粒等，用上述方法染色均不易着色，必须用特殊的方法染色才能着色。这些特殊的染色方法仅在必要时使用。

（一）荚膜染色法

用单染色法菌体周围荚膜不着色，不容易认出。如进行荚膜染色，荚膜则清晰可辩。实际上是菌体染上颜色，荚膜不着色或着色很浅，形成反差而确定了荚膜的存在。

［材料］

1.死于肺炎链球菌感染的小白鼠

2.荚膜染色液(结晶紫染色液)

3.20%硫酸铜冲洗液

4.其他材料同单染色法

［方法］

1.取死于肺炎链球菌感染的小白鼠的心血或腹腔液涂片，室温内自然干燥、固定。

2.滴加结晶紫染液，在火焰上略微加热至产生蒸气为止。

3.用20％硫酸铜液冲洗涂片上的染料至无色为止。

4.用滤纸吸干、镜检。

［结果］

菌体染成紫色，荚膜无色或显淡紫色。

（二）芽胞染色法由于芽胞结构特殊，用一般染色方法难以着色。芽胞染色法就是根据芽胞既难以着色，而一旦着色又难以脱色的特点设计的。

［材料］

1.破伤风梭菌48～72h培养物

2.石炭酸复红液、碱性美兰、95％酒精

［方法］

l.涂片、干燥、固定后，滴加石炭酸复红液，并加温至产生蒸气（不可沸）约5min，随时补充染液以防干涸，待载玻片冷却后，水洗。

2.用95％酒精脱色2min，水洗。

3.滴加美兰染液复染30Sec。水洗，待干，镜检。

［结果］

菌体染成兰色，芽胞染成红色。

（三）鞭毛染色法

细菌的鞭毛细长，直径约10～20nm，光学显微镜不能观察到。但如用特殊染

色，使媒染剂大量沉积在鞭毛上，使其变粗，则在光学显微镜下也可看到。［材料］

1.变形杆菌6～8h的琼脂培养物

2.鞭毛染色液

甲液：5%钾明矾水溶液；1%硷性复红(95%)乙醇溶液；2%鞣酸水溶液 乙液：美兰0.1g；硼砂0.5g；蒸溜水100ml

3.蒸馏水

4.其他同单染色法

［方法］

1.标本的制备从变形杆菌在琼脂培养基上迁移生长的最远处取菌少许，轻轻放在蒸馏水试管中，置l～2min，使菌自行分散，再置37℃作用25～30min。

2.涂片取一接种环上述菌液，滴于洁净玻片上，使其成菌膜，待自然干燥，不进行固定。

3.染色加甲染液3～5min，轻轻水洗；滴加乙染液lmin，并在火焰上方轻微加热（但涂片不可干涸），水洗，待干镜检。

［结果］

菌体染成棕黑色，鞭毛染成浅棕黑色。

（四）异染颗粒染色法

异染颗粒染色法是鉴别白喉杆菌的重要染色法.

［材料］

1.白喉杆菌斜面培养物

2.异染颗粒染色液

甲染色液：俾斯麦褐1g溶于10ml无水乙醇，加90ml蒸馏水充分混合溶解。乙染色液：美兰(或亚甲兰)100mg用乙醇(95%) 2ml溶解后加；冰醋酸5ml 混匀，再加蒸溜水95ml混合而成。

3.其他同单染色法

［方法］

1.涂片、干燥、固定后，滴加甲染色液1min，水洗。

2.滴加乙染色液30Sec，水洗，干燥，镜检。

［结果］

菌体染成浅黄色，异染颗粒染成深兰紫色。